WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

«Том I Ульяновск - 2013 Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 2 ] --

bnii в объектах внешней среды проводили по методикам, предложенным Д.М. Гольдфарбом (191) [].

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследований штаммов B. bnii на наличие профага нами установлено, что культуры без воздействия на них индуцирующего фактора не проявили лизогенных свойств. Проведено 17 опытов, без положительных результатов.

Вторым этапом наших исследований стало выделение бактериофагов B. bnii из объектов внешней среды и от животных. Всего нами исследовано 104 пробы, бактериофаги среди них не обнаружены.

В третьей серии опытов на культуры B. bnii воздействовали индуцирующим фактором (ультрафиолетовыми лучами).

Опыты по облучению бактерий УФЛ проводили с изменением параметров экспозиции в минутах и расстояния до объекта в см. В результате исследований по выделению профага из бактериальных клеток наиболее эффективной показала себя следующая схема:

1 день: посев газоном суточной культуры B. bnii на мясопептонный агар, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее инкубирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37С в течение суток.

2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37С) на сутки.

3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37С) на сутки.

4 день: смыв выросших колоний мясопептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5 день: обработка хлороформом 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин – 15 мин. Снятие надосадочной жидкости в стерильную пробирку.

день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.

После выделения бактериофаги пассировали для повышения их литической активности. В процессе работы по выделению бактериофагов с применением УФЛ в общей сложности нами было проведено 29 экспериментов. Описанным выше методом нам удалось выделить фагов B. bnii из 14 штаммов бактерий. штаммов бактерий B. bnii не проявили лизогенных свойств.

Далее мы изучили биологические свойства выделенных бактериофагов.

Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний мы разделили на два типа. К первому типу отнесли негативные колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по периферии 0,5 – 4 мм или без неё: B.r. – 7 УГСХА, B.r. –2207 УГСХА, B.r. – 214 УГСХА.

Ко второму типу причислили круглые, прозрачные или полупрозрачные колонии, с ровными краями, диаметром до 2 мм: B.r. – 1 УГСХА, B.r. – 10 УГСХА, B.r. – 11 УГСХА, B.r. – УГСХА и B.r. – 8344 УГСХА.

Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 5,3 х 107 до 4,3 х 109. По исследованным параметрам для конструирования диагностического набора фагов отобраны наиболее активные их них: B. bnii - 1 УГСХА по Аппельману 10-7, по Грациа 3,1 х 108 и B. bnii - 7 УГСХА по Аппельману 10-8, по Грациа 4,3 х 109.

Для изучения спектра литического действия выделенных фагов мы использовали культуры бактерий B. bnii.

По результатам исследований наибольшим совместным спектром литического действия обладали бактериофаги B. bnii - 1 УГСХА и B. bnii - 7 УГСХА. Они лизировали 92,5 % имеющихся штаммов.

Учитывая литическую активность и спектр литического действия бактериофагов B.

bnii для дальнейших исследований нами было отобрано 2 фага – B. bnii – УГСХА и B. bnii – 7 УГСХА.

При изучении специфичности действия исследуемых фагов B. Bnii в качестве гетерологичных культур использовали микроорганизмы указанные в материалах и методах. Нами было установлено, что бактериофаги B. r. - 1 УГСХА и B. r. - 7 УГСХА не вызывали лизис ни одной из испытуемых культур других видов бактерий.

В результате исследований температурной устойчивости было установлено, что прогревание фагов B. r. – 1 УГСХА и B. r. – 7 УГСХА при температуре 0С в течении 30 минут не оказало влияния на активность фагов, бактерии погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 5С приводило к потере их активности.

В результате проведенных исследований по изучению устойчивости бактериофагов к воздействию хлороформом установлено, что бактерии инактивируются при 10 минутной обработке. Бактериофаги B.r. – 1 УГСХА и B.r. - 7 УГСХА проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут. Наблюдалось снижение активности фагов при обработке хлороформом свыше 30 минут с 2,2 х 108 до 3,2 х 107 у B.r. – 1 УГСХА и с 2,1 х до 5,3 х 107 у B.r. - 7 УГСХА по методу Грациа. Активность бактериофагов B.r. – 1 УГСХА и B.r. – 7 УГСХА восстанавливалась после одного пассажа.

Затем мы провели селекцию выделенных бактериофагов по основным биологическим свойствам для дальнейшего использования в конструировании диагностического биопрепарата. Отобранные фаги имели прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром 0,5-4,0 мм, литическую активность более 10- по Аппельману, и 5,3 х 107 по Грациа корпускул в 1 мл фаголизата.

Заключение. Мы рекомендуем к применению разработанный нами метод выделения фагов B. bnii путём многократного воздействия ультрафиолетовыми лучами на бактериальную клетку по схеме: 1 день: t = 5-7 мин; = 1м. 2 день: t = 7-10 мин; = 1м. 3 день: t = 7-10 мин; = 0,5м), где t – экспозиция, – расстояние от лампы до объекта. По данной схеме нами было выделено 8 штаммов бактериофагов B. bnii со следующими свойствами:



литической активностью от 10- до 10-9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по методу Грациа, спектром литического действия от 20,8 % до 81,1%. Выделенные бактериофаги были строго специфичны по отношению к B. Bnii, не лизировали бактерии других видов и родов; проявляли устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживали 30 минутное нагревание при 0С.

Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать бактериофаги B.r. – 1 УГСХА и B.r. – 7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой литической активностью по Аппельману 10-7 – 10-8, по Грациа 3,1 х 108 – 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл. Результаты исследований могут быть рекомендованы для дальнейшего конструирования диагностического биопрепарата.

1. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 191. – 521 с.

2. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Применение поБиология фагов лимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных. // Естественные и технические науки. – 2010. - № 5 – С. 230-232.

3. Васильев Д.А., Мастиленко А.В. Сверкалова Д.Г. Васильева Ю.Б. Выделение и идентификация Bd bnii от животных // Естественные и технические науки.

– 2010. - № 5 – С. 233-235.

4. Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Никишина Н.М. Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии. -Ульяновск, 1998. – 151 с.

5. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.

. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 191. – 225 с.

7. Золотухин С.Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С.Н. Золотухин, Л.П.

Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. – 2004. – № 12. – С. 50-53.

8. Bjornstd O.. Evolution nd emergence of Bordetell in humns / O.. Bjornstd, E.T.

rvill // Trends Microiol. – 2005. – 13. – Р. 355-359.

9. Krtev G.I., Lpjev I.., Ryinin O.., Meel. Detection of new cteriophge in Bordetell.//FEM- symposium ertussis. Berlin, GDR.- 1988.- p.20.

10. Mttoo. Role of Bd bnii fimrie in trchel coloniztion nd development of humorl immune response /. Mttoo, J.F. Miller,.. otter // Infect. Immun. – 2000.

– 8. – Р. 2024-2033.

DEVELOPMENT OF METHODS OF ALLOCATION AND SELECTION

OF BACTERIOPHAGES BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Vasileva Y.B., Vasilev D.А., Semanina Е.N.

big, iv in f Bd bnii. T f wn inifi f bigi i f d big: mg ngiv ni, i ivi, m f i in, ifii f in, m bii, in in f fm nd ng f i ivi ding g.

УДК 619:

РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ УМЕРЕННЫХ

И ВИРУЛЕНТНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ

Викторов Д.А., кандидат биологических наук, Тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор Тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru Tел. 9033201410, e-mail: tag78@mail.ru Горшков И.Г., научный сотрудник, Тел. 9170572024, i.o.gun@mail.ru Куклина Н.Г., научный сотрудник, Тел. 9176192488, ul_nk@mail.ru Насибуллин И.Р., соискатель, Тел. 9053484611, nir72@mail.ru Парамонова Н.А., аспират кафедры МВЭиВСЭ Тел. 9170590057, paramonnat@rambler.ru Артамонов А.М., соискатель кафедры МВЭиВСЭ Воротников А.П., студент факультета ветеринарной медицины Тел. 9279807993, vorot.ru@mail.ru Антошкин П.А., студент факультета ветеринарной медицины Тел. 9603604787, vita1468@mail.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Умеренные бактериофаги, вирулентные бактериофаги, лизогения, дифференцирование, микробиология По данным ряда исследователей, разделение бактериофагов на умеренные и вирулентные условно и относительно. Однако показатели умеренности/вирулентности бактериофагов целесообразно выражать так называемым коэффициентом лизогенизации – отношением количества лизогенизированных бактериальных клеток к общему количеству бактерий, подвергнутых единичному циклу фаговой инфекции. Коллективом авторов разработана и апробирована методика дифференцирования умеренных и вирулентных бактериофагов, основанная на выявлении образования лизогенных клеток.

Критерии умеренности / вирулентности бактериофагов играют существенную роль при их селекции для использования в составе терапевтических препаратов и средств деконтаминации, поскольку воздействие умеренных бактериофагов на культуру фагочувствительных бактериальных клеток приводит к её частичной лизогенизации, результатом которой является появление фагорезистентных вариантов. По этой причине в состав биопрепаратов важно подбирать наиболее вирулентные (литические) бактериофаги. Однако к настоящему времени отсутствуют достоверные методы, позволяющие дифференцировать умеренные бактериофаги от вирулентных. Коме того, согласно мнению многих авторов (Ревенко, 1978; Хейс, 195) разделение бактериофагов на умеренные и вирулентные весьма условно и относительно.





Предлагаемая методика основана на отличительной особенности умеренных бактериофагов обусловливать лизогенизацию отдельных клеток чувствительной бактериальной культуры, то есть интегрироватья в генетический аппарат бактерии в виде профага, не вызывая при этом лизис; и позволяет с достаточной объективностью оценивать критерии умеренности / вирулентности бактериофагов.

Ход исследования:

Для исследования готовится мясопептонный агар, разливается в стерильные чашки Петри и тщательно подсушивается при 37 С не менее 24 часов в целях избавления от капель конденсата и усиления гигроскопичных свойств поверхности агара. Суспензию 24-часовой индикаторной культуры бактерий титруют в мясопептонном бульоне до третьего разведения.

Исходная суспензия 24-часовой индикаторной культуры бактерий и каждое из трёх полученных разведений засевается газоном на отдельные подготовленные чашки Петри с подсушенным мясопептонным агаром. Для этого суспензия в количестве 0,7 мл с помощью стерильной пипетки вносится на поверхность МПА и равномерно распределяется по поверхности агара покачивающими движениями, после чего излишек суспензии удаляется стерильной пипеткой, Рис. 1. Схема исследования по дифференциации умеренных и вирулентных бактериофагов.

а чашки переворачиваются крышкой вниз и подсушиваются в термостате при оптимальной для исследуемой бактериальной культуры температуре около 10-30 минут. После полного подсыхания остатков суспензии, полученные четыре чашки с различным разведением бактерий разделяются на сектора, в которые раздельно вносится по 50 мкл исследуемых суспензий бактериофагов в виде капель. Аналогичным образом проводится засев бактериофагов на чашки Петри со стерильным мясопептонным агаром – для контроля на отсутствие жизнеспособных бактерий в исследуемых фаговых суспензиях. Чашки термостатируются при оптимальной для размножения фагов и индикаторных бактерий температуре в течение 18-24 часов.

Индикаторная культура бактерий должна быть гомогенной, не содержать в своём составе постороннюю микрофлору. Препараты бактериофагов должны быть полностью освобождены от бактериальных клеток надлежащими способами обработки.

Для того, чтобы избежать растекания и взаимного перемешивания нанесённых на поверхность агара капель суспензий исследуемых бактериофагов, агар целесообразно разрезать стерильным скальпелем таким образом, чтобы сектора были отделены друг от друга пространством в 2-3 мм (рис. 2, 3).

Схема исследования представлена на рисунке 1.

Оценка результатов:

При оценке результатов, во-первых, учитывается отсутствие роста бактерий на контрольной чашке, куда были засеяны бактериофаги без посева бактериального газона. При обнаружении роста бактериальных колоний на контрольной чашке, результаты исследования нельзя считать достоверными, так как наличие жизнеспособных бактериальных клеток в фаголизате может ввести в заблуждение при оценке роста лизогенных бактерий в опытных чашках.

В данном случае исследование следует повторить, предварительно применив дополнительные способы обработки фаголизата.

Необходимо отметить, что разграничение бактериофагов на умеренные и вирулентные относительно и во многом зависит от особенностей бактериальной тест-культуры и других условий (Ревенко, 1978).

На секторах опытных чашек должен наблюдаться лизис бактериального газона в области нанесения капель испытуемых бактериофагов. Кроме того, в зоне лизиса в той или иной степени может присутствовать рост бактерий, утративших чувствительность к данному бактериофагу вследствие лизогенизации, то есть интеграции профага в генетический аппарат бактериальных клеток, что указывает на умеренность бактериофага. В случае, если во всех четырёх опытных чашках в зоне лизиса определённого бактериофага роста лизогенных бактерий не наблюдается ни в форме менее интенсивного бактериального «газона», ни в форме отдельных колоний лизогенных клеток, данный бактериофаг считается вирулентным. Бактериофаг, в зоне лизиса которого наблюдается рост колоний лизогенных бактерий, считается умеренным.

Причём, степень вирулентности / умеренности бактериофагов оценивается тем наименьшим разведением исходной бактериальной суспензии, при котором наблюдается полный лизис газона без роста лизогенных бактерий. То есть, чем при большей концентрации бактериальных клеток на «газоне» наблюдается полный лизис, без роста лизогенных бактерий, тем данный бактериофаг более вирулентен.

Вывод: Таким образом, было экспериментально установлено, что процесс образования фагорезистентных клеток в культуре чувствительных бактерий зависит, во-первых, от степени вирулентности/умеренности бактериофага, во-вторых, от множественности фаговой инфекции. Очевидно, что с понижением множественности фаговой инфекции возрастает частота лизогенизации.

Биология фагов Рис. 2. Лизис бактериального газона (без разведения) 24-часовой индикаторной культуры Pdmn id ATCC 12633 штаммами бактериофагов:

1 – P102-УГСХА (неполный лизис, в зоне которого бактериальный газон менее чёткий);

2 – P101-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий);

3 – P6-УГСХА (неполный лизис, в зоне которого бактериальный газон менее чёткий);

4 – P1-УГСХА (неполный лизис, в зоне которого бактериальный газон менее чёткий).

Рис. 3. Лизис бактериального газона (разведение -3) 24-часовой индикаторной культуры Pdmn id ATCC 12633 штаммами бактериофагов:

1 – P102-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий);

2 – P101-УГСХА (полный лизис);

3 – P6-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий);

4 – P1-УГСХА (неполный лизис, формирование отдельных колоний лизогенных бактерий).

1. Азизбекян Р.Р. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии / Р.Р. Азизбекян // В кн. Микробиология. Генетика микроорганизмов. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. – М., 1974. – Т.3. – С. 191-233.

2. Висконти Р. Генетика бактериофага / Р. Висконти // В кн.: Онтогенез вирусов. – М., 195. – 141 с.

3. Выделение и анализ фагоустойчивых мутантов Pdmn id с помощью новых бактериофагов / В.Н. Крылов [и др.] // Генетика. – 1981. – Т.17, №2. – С.239-245.

4. Выделение и общая характеристика группы умеренных фагов Pdmn gin / А.С. Яненко [и др.] // Микробиология. – 1979. – Т.48, №1. – С.109-113.

5. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.

. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 191. – 225 с.

7. Жиленков Е.Л. Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага phi с клеткой Pdmn gin / Е.Л. Жиленков // Микробиология. – 1997. – Т., №4. – С.

532-538.

8. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 3 с.

9. Крылов, В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.Н. Крылов // Генетика. – 2003. – Т.39. - №5. – С. 595-19.

10. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:

Урожай. – 1978. – С. 41-88.

11. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. Стент – М.: Мир, 195. – 452 с.

12. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хейс – М.: «Мир», 195. – С. 288-294.

13. dms M.. Bcteriophges / M.. dms – Interscience ulishers, Inc., ew York, 1959. – 473 p.

14. Burnet F.M. Induced lysogenicity nd muttion of cteriophge within lysogenic cteri / F.M. Burnet, D. Lush. // ustrlin J. Exptl. Biol. Med. ci. – 193. – V.14. –. 27-38.

15. Djordjevic M. Quntittive nlysis of virulent cteriophge trnscription strtegy / Djordjevic M. [et l.] // Virology. – 200. – Т. 354. – С. 240.

1. ollowy B. W. Lysogenic conversion in Pdmn gin / B.W. ollowy, G. ooper. // J. Bcteriol. – 192. – V.84. –. 321-324.

17. echev. Bcteriophge-induced modifictions of host R polymerse / echev., everinov K. // nnul Review of Microiology. – 2003. – T. 57. –. 301-322.

18. everinov E. Locliztion of the Eii i R polymerse suunit residue phosphorylted y cteriophge t7 kinse gp0.7 / everinov E., everinov K. // Journl of Bcteriology. – 200. – T. 188. – 10. –. 3470-347.

DEVELOPMENT OF A TECHNIQUE OF THE DIFFERENTIATION OF THE

MODERATE AND VIRULENT BACTERIOPHAGES

Viktorov D.А., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N., Grineva Т.А., Gorshkov I.G., Kuklina N.G., Paramonova N.А., Аrtamonov А.М., Vorotnikov А.P.

Key words: Tm g vin big gnii, diffniin, мibig i ndiin nd iv. Hwv, mdin/vin f big i i x b -d ffiin f gnizin – i f nmb f gnizd bi dvd nd d niq f diffniin f md nd vin g, bd n din f fmin f gni.

Биология фагов УДК 619:

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ФАГОРЕЗИСТЕНТНЫХ

МУТАНТОВ НА ПРИМЕРЕ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS

Викторов Д.А., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Тел. 9084775573, viktorov_da@mail.ru Гринева Т.А., соискатель, Tел. 9033201410, e-mail: tag78@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор Тел. 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Артамонов А.М., соискатель кафедры МВЭиВСЭ Воротников А.П., студент факультета ветеринарной медицины Тел. 9279807993, vorot.ru@mail.ru Антошкин П.А., студент факультета ветеринарной медицины Тел. 9603604787, vita1468@mail.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор Тел. 9272703480, fvm.zol@yandex.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: бактериофаги, фагоустойчивость, фагорезистентность, Pdmn, лизогения.

Проведено экспериментальное получение фагорезистентных вариантов бактериальных штаммов. Механизм фагоризестентности в рассматриваемом случае заключается в лизогенном состоянии бактериальных клеток, обусловленном редуктивной инфекцией штаммами умеренных бактериофагов. Однако в ряде исследований признак фагоустойчивости не был обусловлен лизогенией. Эксперименты проведены на примере бактерий Pdmn id и гомологичных умеренных бактериофагов серии P-УГСХА.

На явление фагоустойчивости обращали внимание отечественные и зарубежные авторы. Beryni G. (1953), изучая умеренные бактериофаги и явление лизогении бактерий, установил, что лизогенные штаммы бактерий всегда иммунны к литической инфекции, осуществляемой тем же умеренным или близкородственным фагом. Koiong Li с соавторами в 191 году высказали предположение, что при лизисе инфицированные фагом бактерии освобождают фермент, который удаляет фаговые рецепторы из оболочек клеток, оставшихся неинфицированными, делая их устойчивыми к адсорбции фага. Dettori R. с соавторами (191) и М. Монк (192) обнаружили, что мужские штаммы E.i К12 способны к приобретению фенотипической устойчивости к фаговой инфекции путём утраты антигена, к которому прикрепляется фаг. Ряд исследователей (Frser, 1957; inder, 1958; Luri et l., 1958) установили, что бактерии могут являться носителями фага, при этом не подвергаясь лизису.

Однако данные, полученные различными авторами при изучении фагоустойчивости бактерий, не систематизированы, а механизмы таких явлений изучены недостаточно.

В связи с этим встает вопрос о детальном и всестороннем изучении явления устойчивости бактерий к фаговой инфекции, систематизации полученных результатов.

Цель исследования: кспериментальное получение фагорезистентных мутантов на примере бактерий рода Pdmn.

Объект, материалы и методы исследования.

В работе использовались ранее выделенные и изученные культуры бактериофагов Рис. 2. Схема получения фагорезистентных мутантов бактерии Pseudomonas putida.

Биология фагов sp101-УГСХА, sp102-УГСХА, sp1-УГСХА, sp-УГСХА, а так же референс-штамм бактеУГСХА, 102-УГСХА, 1-УГСХА, -УГСХА, рии Pdmn id T 1233, чувствительный к перечисленным бактериофагам.

Основываясь на утверждении W. yes (194), согласно которому умеренные бактериофаги, в отличие от вирулентных, формируют «мутные» негативные колонии, в зоне лизиса которых размножаются лизогенные бактерии, нами была составлена схема получения фагорезистентных бактериальных штаммов.

Первоначально по стандартной методики готовили мясопептонный агар, разливали его в стерильные чашки Петри и тщательно подсушивали при 37 С не менее 24 часов в целях избавления от капель конденсата и усиления гигроскопичных свойств поверхности агара. Для исследования был отобран бактериофаг sp101-УГСХА, особенности формирования негативУГСХА, ных колоний которого аналогичны умеренным фагам (yes, 194). Суспензию бактериофага sp101-УГСХА с титром 4х1010 вносили в количестве 0,7 мл на поверхность МПА в заранее подготовленных чашках и равномерно распределяли по поверхности агара покачивающими движениями, ставили в термостат крышкой вверх при 28 С на 10-30 минут для подсушивания.

После полного подсыхания остатков суспензии чашки переворачивали крышкой вниз и термостатировали при 28 С в течение 24 часов для проверки отсутствия во внесённой суспензии бактериальных клеток. Чашки Петри с обнаруженными на поверхности агара бактериальными колониями должны были быть отбракованы, так как наличие нечувствительных к исследуемому фагу бактериальных клеток ввело бы в заблуждение при получении последующих результатов. В наших исследованиях использовалась суспензия фага, полностью очищенная от жизнеспособных бактериальных клеток надлежащими и тщательно подобранными способами обработки фаголизата: воздействие хлороформа в соотношении 1:10 в течение 15 минут при постоянном перемешивании суспензии. Вследствие этого на чашках Петри с внесёным бактериофагом sp101-УГСХА роста бактериальных колоний не обнаруживалось.

Полученные таким образом чашки с питательной средой, содержащей избыточное количество бактериофага sp101-УГСХА, засевали газоном 24-х часовой культуры штамма P.

id T 1233. Для этого 0,7 мл бактериальной взвеси в мясопептонном бульоне, содержащей 108 к.о.е./мл вносили на поверхность агара и равномерно распределяли покачивающими движениями, ставили в термостат при 28 С крышкой вверх и после подсыхания остатков суспензии (через 10-30 минут) переворачивали крышкой вниз. Одновременно аналогичным образом засевали суточную бактериальную культуру штамма P. id T 1233 на МПА без предварительного внесения бактериофага – для контроля роста бактериального газона;

засевали суточную культура на МПА штрихом по методу Дригальского – для контроля однородности колоний и отсутствия посторонней микрофлоры; проводили контрольное определение к.о.е. в суточной культуре; 1-2 чашки с внесённым бактериофагом оставляли без засева бактериальной культурой – для дополнительного контроля на стерильность питательных сред и отсутствия жизнеспособных бактериальных клеток в суспензии бактериофага.

Полученные результаты:

После термостатирования перечисленных посевов при 28 С в течение 24 часов были получены следующие результаты:

1. На чашках с бактериофагом без внесения бактериальной культуры рост бактерий не выявлялся (после 48 часов культивирования при 28 С), что указывает на отсутствие посторонней микрофлоры в питательных средах и фаговой суспензии.

2. В 1 мл 24-часовой бульонной культуры штамма P. id T 1233 содержалось 108 колониеобразующих единиц.

3. На чашках, засеянных суточной культурой штамма P. id T 1233 штрихом по методу Дригальского, наблюдался однородный рост бактериальных колоний, характерных для данного штамма – мелкие (1-2 мм), правильной округлой формы, с ровным краем, рельеф куполообразный, поверхность гладкая, влажная, блестящая, цвет молочно-мутный, прозрачны в проходящем свете, структура однородная, консистенция пастообразная. Наличие посторонней микрофлоры в посевах не наблюдалось, что указывает на гомогенность суточной культуры штамма P. id T 1233.

4. Контрольный газон суточной культуры штамма P. id T 1233 на поверхности МПА без предварительного внесения бактериофага представлял собой сплошной, однородный, равномерный рост бактерий молочно-мутного цвета по всей поверхности агара в чашке Петри.

5. На чашках с МПА, содержащем избыточное количество бактериофага sp101УГСХА и внесённой суспензией суточной культуры штамма P. id T 1233, в отличие от контрольного газона, сплошного роста бактерий не наблюдалось. Вместо этого рост бактериальной культуры был представлен отдельными бактериальными колониями, равномерно распределёнными по поверхности агара. Данные колонии имели аналогичные характеристики с колониями, полученными на контрольном посеве штамма P. id T 1233 штрихом по методу Дригальского – мелкие (1-2 мм), правильной округлой формы, с ровным краем, рельеф куполообразный, поверхность гладкая, влажная, блестящая, цвет молочно-мутный, прозрачны в проходящем свете, структура однородная, консистенция пастообразная (рис. 1).

. Количество бактериальных колоний, образовавшихся на МПА, содержащем бактериофаг sp101-УГСХА, после внесения 0,7 мл суспензии суточной культуры, содержащей клеток штамма P. id T 1233 в 1 мл, составило 104 колоний, что соответствует примерно 1:7000 части от изначального количества клеток в суспензии суточной культуры бактерий.

Однако данный показатель определён приблизительно, для получения более точных данных требуется проведение серии дополнительных исследований.

Колония штамма P. id T 1233, образованная на мясопептонном агаре, содержащем избыточное количество бактериофага sp101-УГСХА, была отвита на полужидкий агар для дальнейших исследований. Полученному таким образом фагорезистентному штамму P. id присвоен номер p02phr1.

Общая схема исследования представлена на рисунке 2.

Принимая во внимание отсутствие роста бактерий на контрольных чашках, что говорит о стерильности питательных сред и об отсутствие посторонней микрофлоры в фаголизате sp101-УГСХА, особенности роста колоний штамма P. id p02phr1 на мясопептонном агаphr ре, содержащем избыточное количество бактериофага sp101-УГСХА в сравнении с ростом бактериального газона, полученного при аналогичном посеве на мясопептонный агар, не содержащий бактериофаг, а так же однородность колоний штамма P. id T 1233, полученного на чашках, засеянных штрихом по методу Дригальского и их морфологическая однотипность с колониями P. id p02phr1 на опытных чашках с бактериофагом, правомерно сделать вывод о том, что последние колонии образованы бактериальными клетками штамма P.

id p02phr1, резистентными к бактериофагу sp101-УГСХА.

Биология фагов Рис. 1 - Образование колоний фагорезистентного штамма P. id Pp02phr1 на агаре, содержащем избыточное количество бактериофага Psp101-УГСХА.

1. Азизбекян Р.Р. Изменение наследственности бактерий путем фаговой конверсии / Р.Р.

Азизбекян // В кн. Микробиология. Генетика микроорганизмов. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. – М., 1974. – Т.3. – С. 191-233.

2. Викторов, Д.А. Система тестов для диагностики псевдомоноза рыб, вызываемого бактерией Pdmn id / Д.А. Викторов, И.И. Богданов, А.Г. Шестаков // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых учёных, ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ - Покров, 2009. – С. 13-140.

3. Висконти Р. Генетика бактериофага / Р. Висконти // В кн.: Онтогенез вирусов. – М., 195. – 141 с.

4. Выделение и анализ фагоустойчивых мутантов Pdmn id с помощью новых бактериофагов / В.Н. Крылов [и др.] // Генетика. – 1981. – Т.17, №2. – С.239-245.

5. Выделение и общая характеристика группы умеренных фагов Pdmn gin / А.С. Яненко [и др.] // Микробиология. – 1979. – Т.48, №1. – С.109-113.

. Габрилович И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск. – 1973. – С. 5-24.

7. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // М.: Медгиз. – 191. – 225 с.

8. Жиленков Е.Л. Изучение начальных стадий взаимодействия умеренного фага phi с клеткой Pdmn gin / Е.Л. Жиленков // Микробиология. – 1997. – Т., №4. – С.

532-538.

9. Золотухин С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий / С.Н. Золотухин // Автореф. дис.... д-ра биол. наук. - Ульяновск, 2007. – 39 с.

10. Зуева, Л.П. Бактериофаги – факторы эволюции госпитальных штаммов и средства борьбы с инфекциями / Л.П. Зуева, Б.И. Асланов, А.А. Долгий, А.Е. Гончаров, А.И. Архангельский // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. – 2012. - №1. – С. 9-13.

11. Каттер Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / Э. Каттер, А. СулакБиология фагов велидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. – Москва: Научный мир, 2012. – 3 с.

12. Крылов, В.Н. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.Н. Крылов // Генетика. – 2003. – Т.39. - №5. – С. 595-19.

13. Кульба А.М. Биологические свойства и нуклеотидный состав ДНК бактериофагов Pdmn / А.М. Кульба, А.С. Горелышев // Микробиология. – 1981. – Т.50. – C. 53- 14. Методы получения, концентрации и очистки бактериофагов, поражающих фитопатогенные бактерии рода Pdmn / Ж.И. Оемчук [и др.] // Пробл.общ.и молекул. биол. – Киев,1988. – №7. – С. 97-100.

15. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике. – Киев:

Урожай. – 1978. – С. 41-88.

1. Стент Г. Молекулярная биология вирусов бактерий / Г. Стент – М.: Мир, 195. – 452 с.

17. Тимаков В.Д. Об условиях взаимодействия фага и бактериальной клетки / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // Вестник АМН СССР. – 1958. – №2. – С. 37.

18. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий / А.С. Тихоненко – М.: Наука, 198. – С. 89-18.

19. Хейс У. Генетика бактерий и бактериофагов / У. Хейс – М.: «Мир», 195. – С. 288-294.

20. dms M.. Bcteriophges / M.. dms – Interscience ulishers, Inc., ew York, 1959. – 473 p.

21. Berdygulov. Temporl regultion of gene expression of the Tm mi cteriophge p23-45 / Berdygulov. [et l.] // Journl of Moleculr Biology. – cdemic ress. – 2011.

– T. 405. – 1. –. 125-142.

22. Brdley D.E. The structure nd infective process of Pdmn gin cteriophge contining rionucleic cid / D.E. Brdley // J. Gen. microiol. – 19. – V.45. –. 83-9.

23. Burnet F.M. Induced lysogenicity nd muttion of cteriophge within lysogenic cteri / F.M. Burnet, D. Lush. // ustrlin J. Exptl. Biol. Med. ci. – 193. – V.14. –. 27-38.

24. Djordjevic M. Quntittive nlysis of virulent cteriophge trnscription strtegy / Djordjevic M. [et l.] // Virology. – 200. – Т. 354. – С. 240.

25. Enikeev F.. Restriction-modifiction systems nd cteriophge invsion: who wins?

/ Enikeev F.., Gelfnd M.., everinov K.V. // Journl of Theoreticl Biology. – cdemic ress. – 2010. – T. 2. – 4. –. 550-559.

2. ollowy B. W. Lysogenic conversion in Pdmn gin / B.W. ollowy, G.

ooper. // J. Bcteriol. – 192. – V.84. –. 321-324.

27. Minkhin L. Trnscription regultion y cteriophge t4 si / Minkhin L., everinov K.

// rotein Expression nd urifiction. – cdemic ress. – 2005. – T. 41. – 1. - 1-8.

28. Minkhin L. Genome comprison nd proteomic chrcteriztion of Tm micteriophges p23-45 nd p74-2: siphoviruses with triplex-forming sequences nd the longest known tils / Minkhin L. [et l.] // Journl of Moleculr Biology. – 2008. – T. 378. – 2. –. 48-480.

29. echev. Bcteriophge-induced modifictions of host R polymerse / echev., everinov K. // nnul Review of Microiology. – 2003. – T. 57. –. 301-322.

30. vli D. The role of the t7 gp2 inhiitor of host R polymerse in phge development / vli D. [et l.] // Journl of Moleculr Biology. – cdemic ress. – 2010. – T. 402. – 1. –.

118-12.

31. everinov E. Locliztion of the Eii i R polymerse suunit residue phosphorylted y cteriophge t7 kinse gp0.7 / everinov E., everinov K. // Journl of Bcteriology. – 200. – T. 188. – 10. –. 3470-347.

Биология фагов

EXPERIMENTAL DETERMINATION OF PHAGORESISTANT MUTANTS

BY THE EXAMPLE OF BACTERIA OF THE GENUS PSEUDOMONAS

Viktorov D.А., Grineva Т.А., Vasilev D.А., Аrtamonov А.М., Vorotnikov А.P., Antoshkin P.A., Zolotukhin S.N.

Key words: big, g in, fgzinn, Pdmn, gn.

mnim f gin in nd nidin i in gni f bi, d b div infin b in f m g. Hwv, in nmb f ign f gin w n mivd b gni. Eximn w id b xm f bi f Pdmn id nd mg m g f i P-UAA.

УДК 578.

БАКТЕРИОФАГИ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: ВЫДЕЛЕНИЕ,

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ГЕНОМНЫЙ АНАЛИЗ И

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Воложанцев Н.В., кандидат биологических наук, тел. 7-4967-36-01-47; nikvol@obolensk.org Веревкин В.В., кандидат биологических наук Красильникова В.М., кандидат биологических наук, Мякинина В.П., Левчук В.П., Светоч Э.А., доктор ветеринарных наук, профессор, тел. 7-4967-36-00-79; svetoch@obolensk.org Дятлов И.А., чл. корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор;

тел. 7-4967-36-00-03; dyatlov@obolensk.org ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора B.S. Seal, PhD, Poultry Microbiological Safety Research Unit, R.B. Russell Agricultural Research Center, Agricultural Research Service, USDA Phone: 1-706-546-3549; bruce.seal@ars.usda.gov Ключевые слова: бактериофаги, Cidim fingn, геномный анализ, амидаза Представлены результаты изучения биологических и молекулярно-генетических свойств бактериофагов, лизирующих бактериальные клетки Cidim fingn. Обсуждаются перспективы использования бактериофагов и их литических ферментов для контроля C. fingn - инфекций Cidim fingn - одна из основных причин заболеваний людей, передающихся с продуктами питания [1, 2]. Кроме того, эти грамположительные анаэробные бактерии выБиология фагов зывают некротический энтерит птиц – болезнь широко распространённую во многих странах мира, занимающихся интенсивным птицеводством [3]. Существенное сокращение, а в последующем и полное исключение применения антибиотиков - стимуляторов роста при производстве птицы требуют от исследователей поиска новых научных подходов для разработки средств, позволяющих эффективно бороться с такими патогенами человека и животных, как C. fingn.

Использование литических бактериофагов и их литических ферментов для контроля C. fingn – один из возможных подходом в борьбе с этим патогеном на птицеводческих фермах и на перерабатывающих предприятиях.

Материалы и методы исследований.

Бактериофаги идентифицировали с помощью спот-теста и последующего титрования на чувствительных штаммах C. fingn. «Чистые» препараты фагов получали из изолированной негативной колонии после трёх последовательных пересевов на газоне чувствительного штамма. Специфичность и спектр антибактериального действия фагов определяли методом спот-тестирования и стандартным двуслойным методом с использованием 50 штаммов C. -.

fingn.

Оценку эффективности препарата бактериофага pV1 в экспериментах in viv проводили на четырнадцатидневных бройлерных цыплятах, которых инфицировали суспензией двух штаммов C. fingn, содержащих маркер устойчивости к рифампицину и чувствительных к фагу, в объеме 0,2 мл (3107 - 1108 КОЕ) на 19, 20, 21 и 22 дни жизни. Препарат фага в объеме 0,2 мл вводили птице per os дважды в день в те же сроки.

Фаговую ДНК выделяли из обработанного протеиназой К фаголизата на колонках фирмы QIGE (QImp D Midi Kit). Эксперименты по клонированию гена амидазы бакQImp ).

териофагов C. fingn в клетках E.i проводили по стандартным протоколам [4]. Полноразмерный ген амидазы нарабатывали в ПЦР с использованием специфических праймеров, в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции.

Для оценки антибактериальной активности продуктов клонированных генов использовали белковую фракцию, выделенную из клеток штамма E.i, содержащих рекомбинантную плазмиду. В качестве контроля использовали белковый препарат, выделенный из изогенного штамма E.i с нативной плазмидой. Активность препаратов оценивали методом споттеста на газоне живой культуры C. fingn (культивирование 18 час. при температуре 37°С в анаэробных условиях).

Результаты исследований и их обсуждение.

При анализе материала, отобранного на птицефабриках Московской и Калужской областей России, выделено 30 бактериофагов, обладающих литической активностью против бактерий C. fingn.

На основании рестрикционного анализа ДНК бактериофаги были разделены на шесть групп. Наиболее многочисленными оказались группы pV1- и pV4-подобных короткохвоподобных стых фагов, отнесенных к семейству Pdviid. Установлено, что все фаги имеют высокую специфичность и способны размножаться не более чем на одном–шести штаммах C. fin-.

gn. Однако при множественности инфицирования более 100 БОЕ/КОЕ фаги способны задерживать рост бактерий в питательном бульоне и формировать негативные пятна роста на газонах около 30 % штаммов.

С целью выбора оптимальной схемы применения бактериофагов для предотвращения С. fingn инфекций у птицы провели серию экспериментов по изучению персистенции одного из литических фагов, pV1, в желудочно-кишечном тракте бройлерных цыплят (при однократном введении фага в дозе 108 БОЕ/особь). Полученные результаты показали, Биология фагов Рис. 1 - Титры Cidim fingn и участками колонизации и размножения фага CpV1 в нижних отделах ЖКТ бройлерных этого возбудителя.

цыплят. Группы 1 и 3 – бройлеры, инфицирооценке терапевтического действия препаванные культурой двух RifR-штаммов C. finратов бактериофагов показали, что обраgn (1 раз в день, в течение 4-х дней); группы и 3 - бройлеры, получающие бактериофаг CpV1 уровня колонизации кишечника бройлердважды в день в течение 4-х дней). ных цыплят культурой C.fingn, чувствительной к этому фагу, на фоне роста титра фага (рис. 2). В тоже время, эксперименты по фаготерапии бройлеров, естественно инфицированных C. fingn, с использованием коктейля фагов не увенчались успехом (данные не представлены), что, очевидно, связано с узким спектром литической активности фагов.

Естественные изоляты C. fingn, выделенные из бройлеров, оказались резистентными к фагам, которые использовали в экспериментах.

Одним из научных направлений, которое, возможно, позволит преодолеть трудности в практике применения бактериофагов в борьбе с C.fingn, является изучение геномов бактериофагов с помощью секвенирования фаговой ДНК и идентификации генов, ответственных за синтез литических ферментов, которые могут иметь самостоятельное терапевтическое значение и оказаться более перспективными, чем препараты нативных фагов. В связи с этим были проведены эксперименты, позволившие более детально изучить геномы трех выделенных нами бактериофагов семейства Pdviid pV1, pV4 и 2 [5, ]. Результаты полногеномного анализа показали, что геномы этих бактериофагов представлены двунитевой линейной ДНК, содержащей соответственно 1747, 17972 и 18078 пар нуклеотидов (п.н.) с короткими концевыми инвертированными повторами (25, 28 и 30 п.н., соответственно) и кодируют от до 28 потенциальных генов. Бактериофаги pV4 и 2 по структуре генома оказались наиболее близкими (88 % гомологии на уровне ДНК). Интересно отметить, что еще более высокий процент идентичности (95 %) выявлен между фагами pV4 и CP7R, последний из которых выделен в лаборатории из Richrd B. Russell griculturl Reserch enter, т.е. гомологичные фаги выявлены в двух существенно отдаленных географических регионах, России и США [].

В геноме исследованных фагов идентифицированы, по крайней мере, четыре геномных кластера, ответственные за репликацию фаговой ДНК, ее упаковку, синтез структурных компонентов фага и литические свойства. К последним отнесены предполагаемые пептиды, имеющие гомологию с -cetylmurmoyl-L-lnine амидазой и lysozyme-эндопептидазой.

Гены фагов pV1 и pV4, кодирующие -cetylmurmoyl-L-lnine амидазу, были клонированы и экспрессированы в клетках E. i. Показано, что белковый препарат из рекомбинантного штамма E.i (pU19-4H3) с геном амидазы фага pV4 обладает выраженной литической активностью по отношению к тестируемым штаммам C. fingn (рис.2). ПриБиология фагов Рис. 2 - Литическая активность амидазы фага CpV4 по отношению к бактериям C. fingn ATCC3624 (A), cp0650 (B) и ATCC13124 (C).

1 – бактериофаг pV4 (1010 БОЕ/мл); 2 – белковый препарат из рекомбинантного штамма E.i D5a (pU19-4H3) с геном амидазы фага pV4; 3 – белковый препарат из штамма E.i D5a с нативной плазмидой pU19.

чем, препарат лизирует как чувствительные, так и устойчивые к фагу pV4 штаммы (табл. 1).

Таблица 1 - Сравнение литической активности препарата амидазы и бактериофага CpV Штаммы, на которых фаг pV4 способен размножаться Штаммы, устойчивые к фагу pV “+” – выраженное пятно лизиса; “-” – отсутствие лизиса Заключение. Бактериофаги являются потенциальными средствами лечения бактериальных инфекций. Однако узкая специфичность фагов, возможное развитие устойчивости бактерий к своим вирусам - все это указывает на необходимость постоянного поиска новых Биология фагов изолятов фагов для использования их в терапевтических целях. Еще в 1959 г..W.mith обраW.mith тил внимание на отсутствие чувствительности многих штаммов C. fingn к выделенным бактериофагам [7]. То же самое мы наблюдали в наших исследованиях, где большинство литических бактериофагов C. fingn имели ограниченный диапазон хозяев. В связи с этим, кажется маловероятным, что какой-либо «коктейль» бактериофагов окажется эффективным против всех бактериальных изолятов C. fingn, которые существуют в окружающей среде. В этом отношении, кажется более перспективным использование фаговых литических ферментов для контроля C. fingn-инфекций. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ген амидазы фага pV4, клонированный в рекомбинантном штамме E.i, детерминирует синтез продукта, обладающего литической активностью против бактерий C. fingn. Причем, этот продукт лизирует не только бактериальные штаммы, чувствительные к фагу pV4, но и штаммы устойчивые к этому фагу.

Таким образом, амидазы фагов, осуществляющие расщепление пептидогликана бактериальной клеточной стенки, могут расцениваться как потенциальные терапевтические средства против C. fingn.

1. Brynestd. Cidim fingn nd foodorne infections / Brynestd., Grnum.E. // Int. J. Food Microiol. – 2002. – Vol. 74(3). –.195-202.

2. Lindstrm M. ovel insights into the epidemiology of Cidim fingn type food poisoning / Lindstrm M., eikinheimo., Lhti., Korkel.// Food Microiol. – 2011. – Vol.28(2). –.192-198.

3. Vn Immerseel F. Cidim fingn in poultry: n emerging thret for niml nd pulic helth / Vn Immerseel F., De Buck J., smns F., uygheert G., eserouck F., Ductelle.R // vin thol. – 2004. – Vol.33 (). –. 537-549.

4. mrook J., Fritsch EF, Mnitis T. Moleculr loning: Lortory Mnul. old pring ror L, old pring ror, Y. 5. Volozhntsev .V. The genome sequence nd proteome of cteriophge V1 virulent for Cidim fingn / Volozhntsev.V., Verevkin V.V., Bnnov V.., Krsilnikov V.M., Mykinin V.., hilenkov E.L., vetoch E., tern.J., Okley B.B., el B.. // Virus Res. – 2011.

– Vol. 155. –. 433–439.

. Volozhntsev.V. Moleculr hrcteriztion of odovirl Bcteriophges Virulent for Cidim fingn nd Their omprison with Memers of the Piviin / Volozhntsev.V., Okley B.B., Morles.., Verevkin V.V., Bnnov V.., Krsilnikov V.M., opov.V., hilenkov E.L., Grrish J.K., chegg K.M., Woolsey R, Quilici D.R, Line J.E, iett K.L, irgus G.R, vetoch E., el B.. // Lo OE – 2012. – 7(5): e38283.

7. mith.W. The cteriophges of Cidim fingn // J Gen Microiol. – 1959. – Vol.21. –. 22-

BACTERIOPHAGES OF CLOSTRIDIUM PERFRINGENS: ISOLATION,

BIOLOGCAL PROPERTIES, GENOMIC ANALYSIS AND POTENTIALITY

OF PRACTICAL USE

Volozhantsev N.V., Bannov V.A., Verevkin V.V., Myakinina V.P., Levchuk V.P., Svetoch E.A., Dyatlov I.A., Seal B.S.

Key words: big, Cidim fingn, gnm ni, mid Cidim fingn nd. Pni f big nd i i nzm n C.fingn infin i did УДК 579.

ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИИ РОДА AZOSPIRILLUM С ПОМОЩЬЮ

БАКТЕРИОФАГОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ AZOSPIRILLUM BRASILENSE

Гулий О.И.*, Караваева О.А.*, Макарихина С.С.*, *Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов **Национальный исследовательский Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Тел.: 8(8452)970444, e-mail:guliy_olga@mail.ru Ключевые слова: Aziim bin, бактериофаг, детекция.

Работа посвящена исследованию возможности применения бактериофагов, выделенных из почвенных микроорганизмов Aziim bin штаммов 7 и R75, для детекции клеток Aziim с помощью метода электрооптического (ЭО) анализа микробных суспензий. При проведении исследований авторами определен минимальный предел детекции клеток, который составляет 104 клеток/мл. Установлена возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции клеток азоспирилл при их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры Введение. Одной из актуальных проблем современной биотехнологии является разработка новых подходов для детекции бактерий с помощью бактериофагов [1-2]. Этому вопросу посвящено сравнительно большое количество научных статей, однако, развитию методов детекции почвенных микроорганизмов, уделяется недостаточное внимание, хотя роль этих микроорганизмов весьма значительна как для развития фундаментальных исследований, так и для современной сельскохозяйственной биотехнологии.

Перспективным направлением исследований является выделение и изучение бактериофагов почвенных микроорганизмов, в том числе бактериофагов Aziim bin, а также разработка новых методов индикации почвенных бактерий с помощью бактериофагов.

Целью работы являлось изучение возможности применения бактериофагов, выделенных из Aziim bin штаммов p7 и R75 для детекции бактерий рода Aziim с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы.

В работе использовали микроорганизмы A. bin штаммов p7, d, p107, p245, JmB2, Br14, KR77, S17, S27, R55, R75, A. mznn m14, A. fn u4, A. ikn штаммов KB1, KА3, A. ifm штаммов p59b, R5, RG20, Eii i штаммов B-878, XL-1, из коллекции культур Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) (Саратов). Микроорганизмы хранились при +4°С на чашках Петри с картофельным агаром (3%) и пересевались каждые 2 недели.

Условия культивирования микробных клеток: культуры бактерий выращивали в мл колбах Эрленмейера на жидкой среде LB [3] – следующего состава (г/л): l (Becton, Dickinson nd ompny, Франция) – 10,0, пептон (Becton, Dickinson nd ompny, Франция) Биология фагов – 5,0, дрожжевой экстракт (DIFO, США) – 5,0. Инкубирование клеток оcуществляли на круDIFO,, cуществляли говой качалке при интенсивности перемешивания 10 об/мин при температуре 30±1°С в течение 18-20 ч.

Методы. В ходе выполнения работы применяли традиционные методы культивирования микроорганизмов на питательных средах [4]. Выделение бактериофагов проводили методами, предложенными [4]. Инфицирование клеток бактериофагом проводили согласно [5].

Изучение электрооптических параметров суспензий клеток A. bin штаммов p7 и R с использованием выделенных бактериофагов проводили согласно методике [5].

Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 повторностей. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом []. Для статистической обработки экспериментальных данных также использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2000.

Результаты и обсуждение. Для выполнения исследований использовали бактериофаги, выделенные из клеток Aziim bin штаммов p7 и R75 [7]. Изучалась возможность использования выделенных бактериофагов для детекции клеток азоспирилл с помощью метода электрооптического (ЭО) анализа клеточных суспензий. Методы ЭО анализа микробных суспензий основаны на регистрации изменения оптических свойств микробной суспензии под влиянием переменного электрического поля. При воздействии на бактериальные клетки антителами [8] и вирусами [5] происходит изменение ЭО параметров бактериальных суспензий. И наоборот, если вещество или частица присутствует в среде роста, но не взаимодействует с клетками, изменения величины ЭО параметров не происходит [5; 8; 9; 10].

Первоначально проводилась оптимизация условий измерения ЭО параметров суспензии клеток A. bin штаммов p7 и R75, которая включала в себя напряженность электрического поля 17 В/см при времени приложения электрического поля 1 сек и проведение измерений на частотах 740, 1000, 1450, 2000 и 2800 кГц. Электропроводность воды во всех случаях составляла 1, µ/m. В предварительных экспериментах было показано, что изменеm.

ние величины ЭО сигнала происходит при внесении бактериофага из расчета 20 бактериофагов на 1 бактерию, поэтому мы использовали те же условия.

Далее изучали динамику изменений величины ЭО сигнала суспензии клеток A. bin p7 и A. bin R75 при их инфицировании бактериофагами -р7 и Ab-R75.

Для этого в суспензию клеток A. bin p7 и A. bin R75 (108 клеток/мл) вносили соответствующий бактериофаг, затем проводили инкубацию при температуре 37°С в течение 1, 5, 10, 20 и 30 минут. При инфицировании клеток A. bin штаммов p7 (рис. 1 (А)) и R75 (рис. 1 (Б)) соответствующими бактериофагами наблюдалось изменение величины ЭО сигнала уже через 1 мин от начала инфекции, что, вероятно, связано с адсорбцией бактериофага на поверхности клетки. Следует отметить, что изменения величины ЭО сигнала суспензий клеток A. bin штаммов p7 и R75 после 5, 10, 20 и 30 мин от начала инфекции клеток бактериофагом фиксировались в пределах 5%.

Д, относительных единиц Рис. 1. - Динамика изменений ОС суспензии клеток A. rsiese Sp7 (А) при добавлении бактериофага A-Sр7 и суспензии клеток A. rsiese SR75 (Б) при добавлении бактериофага A-SR75: (1) – контроль – суспензия клеток без бактериофагов; время от начала инфекции: (2) –1 мин; (3) – 5 мин; (4) –10 мин; (5) –20 мин; () – 30 мин Одним из важных параметров при развитии нового метода детекции клеток является определение минимального количества детектируемых клеток. Поэтому проводили измерения при количестве клеток в ячейке 10, 104 и 102 клеток/мл. Установлено, что предел детекции микробных клеток A. bin штаммов p7 (рис. 2 (А)) и R75 (рис. 2 (Б)) при их инфекции бактериофагами -р7 и Ab-R75 с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий составляет 104 клеток/мл.

Рис. 2. - Изменение величины ЭО сигнала суспензии клеток A. rsiese Sp7 (А) при их инфекции бактериофагом A-Sр7 и A. rsiese SR75 (Б) при их инфекции бактериофагом A-SR75. Количество клеток в ячейке – 10 клеток/мл. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов Важным этапов в развитии метода детекции клеток является получение аналитического сигнала при наличии мешающих факторов и, прежде всего, в присутствии посторонней микрофлоры. Поэтому нами проводились измерения ЭО параметров суспензии клеток A.

bin штаммов p7 и R75 при их инфекции бактериофагами -р7 и -R75, соотR75, ветственно, в присутствии клеток E. i штаммов B-878 и XL-1.

Для этого к смешанной суспензии A. bin p7, E. i B-878 и E. i XL-1 и смешанной суспензии A. bin R75, E. i B-878 и E. i XL-1 (количество клеток в измерительной ячейке 10 клеток/мл, взятых в равном соотношении (1:1:1), вносили определенный бактериофаг. В качестве контроля использовалась смешанная суспензия A. bin p7, E.

i B-878 и E. i XL-1 без внесения бактериофага. В результате было показано, что при инфекции клеток A. bin штамма p7 бактериофагом -р7 (рис. 3 (А)) и клеток штамма R75 бактериофагом Ab-R75 (рис. 3 (Б)) в присутствии клеток E. i В-878 и E. i XL-1, происходит значительное снижение величины ЭО сигнала.

Дополнительно проводились контрольные эксперименты по изучению неспецифического взаимодействия бактериофагов -р7 и Ab-R75 с клетками E. i штаммов B- и XL-1, при этом было показано, что изучаемые бактериофаги не инфицируют клетки E. i штаммов B-878 и XL-1.

Д относительных единиц Рис. 3. - (А) Изменение величины ЭО сигнала смешанной суспензии клеток E. coi B-878 + E. coi XL-1 + A. rsiese Sp7 при добавлении бактериофага A-Sр7; (Б) суспенA-Sр7; Б) зий клеток E. coi B-878 + E. coi XL-1 + A. rsiese SR75, при добавлении бактериофага A-SR75. (1) – контроль – суспензия клеток без добавления бактериофагов; (2) – суспензия клеток с добавлением бактериофагов Полученные результаты показывают возможность использования бактериофагов -р7 и Ab-R75 для детекции микробных клеток с помощью метода электрооптического анализа клеточных суспензий в присутствии посторонней микрофлоры.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана возможность детекции микробных клеток азоспирилл при их инфекции специфическим бактериофагом с помощью метода электрооптического анализа микробных суспензий. Определен минимальный предел детекции клеток, который составляет 104 клеток/мл. Установлена возможность использования метода электрооптического анализа микробных суспензий для детекции клеток азоспирилл при их взаимодействии со специфическими бактериофагами в присутствии посторонней микрофлоры Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение №8852 «Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов микроорганизмов» (номер заявки в информационной компьютеризированной системе 2012-1.5-14-000-2021-004 (2012-2013 гг.) 1 chofield D.., hrp. J., Westwter. hge-sed pltforms for the clinicl detection of humn cteril pthogens // Bcteriophge. 2012. Vol. 1;2(2)..105-283.

2. chofield D, Molineux IJ, Westwter. Rpid identifiction nd ntiiotic susceptiility testing of Yini i using ioluminescent reporter phge.// J Microiol Methods. 2012. Vol.

90(2)..80-82.

3. mrook J., Fritsch D.F., Mnitis T. Moleculr Сloning: Lortory Mnul. 2nd ed.

(v.1–3). old pring ror; ew York; old pring ror L. ress, 1989. – 159 p.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ. – М.: Мир, 1984. – 480 с.

5. Bunin V.D., Igntov O.V., Guliy O.I., itsev I.., Dykmn L.., O’eil D., Ivnitski D.

Electro-opticl nlysis of the Eii i–phge interction. // nl. Biochem. – 2004. – Vol.

328. –.181-18.

. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. – Л.:

Химия, 1984. – 18 с.

7. Караваева О.А. Детекция бактерий рода Aziim с помощью бактериофагов, выделенных из Aziim bin штаммов p7 и R75// Дис. … кандидата биол. наук. – Саратов. – 2012. – 173 с.

8. Bunin V.D., Igntov O.V., Guliy O.I., Voloshin.G., Dykmn L.., O’eil D., Ivnitski D. tudies of Lii mngn-ntiody inding using electro-orienttion // Biosens. Bioelectron. – 2004. – Vol. 19, Is. 2. –. 1759-171.

9. Гулий О.И., Маркина Л. Н., Игнатов О.В., Щеголев C. Ю., Зайцева И. С., Бунин В.Д., Игнатов В.В. Влияние ампициллина на электрофизические свойства клеток Eii coli // Микробиология. – 2005. – Т.74, №1. – С. 12-131.

10 Гулий О. И., Маркина Л. Н., Бунин В. Д., Игнатов В.В., Игнатов О. В. Исследование электрооптических параметров суспензий клеток Eii i при действии канамицина // Микробиология. – 2008. – Т.77, №3. – С. 380-385.

DETECTION OF BACTERIA AZOSPIRILLUM BY BACTERIOPHAGES

ISOLATED FROM AZOSPIRILLUM BRASILENSE STRAINS SP7 AND SR

Guliy O.I., Karavaeva O.A., Makarihina S.S., Pavliy S.A., Ignatov O.V.

Key words: Aziim bin, big, din Aziim bin in 7 nd R75, f din f Aziim ing i (EO) ni f mibi nin. In b dmind minimm din imi f, wi i 104 / m. T ibii f ing md f i ni f din f mibi nin zii g i inin wi ifi big in n f xn mifl.

Биология фагов УДК 578.819.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА НОВОГО КОЛИФАГА PHIKT,

БЛИЗКОРОДСТВЕННОГО ФАГУ CAULOBACTER CRESCENTUS CD

Куликов Е. Е. *, Тарасян К. К. *, Голомидова А. К. *, Прохоров Н. С. *, Исаева А. С. *, Строцкая А. В. *, Татарский Е. В.*, Летарова М. А. *, Кутузова Н. М.**, Клунова С. М. **, Летаров А. В. * * ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН», 113719, г. Москва, пр. 60-летия Октября, 7/2, тел. +7(499)135-21-39, inmi@inmi.host.ru **ФГБОУ ВПО «Московский государственный педагогический университет», 119991, г. Москва, ул. Малая Пироговская, 1/1, тел. +7(499)245-03-10, biochem_ Автор для корреспонденции Летаров А. В., letarov@gmail.com Ключевые слова: геном бактериофага, Cb n, Eii i, iKT Приведены результаты предварительного анализа генома нового вирулентного бактериофага iKT, выделенного из фекалий лошади, и активного против кишечной палочки Eii i. Показано, что новый фаг имеет высокое сходство ряда генов обмена нуклеиновых кислот и структурных генов с ранее описанным фагом iCD1, инфицирующим подвижные формы значительно отдалённой от E. i свободноживущей олиготрофной водной альфа-протеобактерии Cb n. Полученный результат показывает возможность значительного изменения спектра активности бактериофагов определённых групп путём модификации генов, лежащих вне “корового” участка генома фага, ответственного за репликацию вирусного генома, взаимодействие с макромолекулами клетки-хозяина, и структуру вирусной частицы.

В 2010 году сотрудниками лаборатории вирусов микроорганизмов ИНМИ РАН из фекалий лошади был выделен новый бактериофаг phiKT, обладающий типичной для подовирусов морфологией (типа фага Т7), и проявляющий литическую активность против достаточно узкого спектра штаммов кишечной палочки Eii i, выделенных параллельно из тех же образцов фекалий (штаммы 53 и 30/70) в рамках получения коллекции штаммов бактерий, обладающих различной устойчивостью к природным изолятам колифагов.

Свежие фекалии лошади, отобранные стерильно, разводили в соотношении 1+ (масса/масса) фаговым раствором (200 mM l, 100 мг/л азида натрия, 1 мл/л Tween 20), и инкубировали 1 час на ротаторе (120 оборотов в минуту). Полученные экстракты осветляли фильтрованием через марлю, и осветлённые препараты фильтровали через бактериальный фильтр (crodisc, 0.22 мкм) с префильтром. Аликвоту осветлённого препарата высевали на селективную для энтеробактерий среду LT (Luryl-tryptose gr), содержащую 0.1 г лаурилсульфата натрия на литр, полученные колонии дополнительно идентифицировали на способность утилизировать лактозу на индикаторной среде Эндо. Полученные колонии микробов отсевали, и тестировали на чувствительность изолированных штаммов к бактериофагам из отфильтрованных стерильных экстрактов методом посева по Грациа. Отдельные бляшки фагов перекалывали на газоны штамма E. i, на которых было проведено первичное выделение, и затем получали жидкие фаговые лизаты этих же штаммов. После скрининга лизатов на гомогенность морфологии вирионов методом трансмиссионной электронной микроскопии провоБиология фагов дили препаративное ультрацентрифугирование фагов (ротор Beckmn W28, 1 час при g). Осадки фагов использовали для выделения ДНК фенольным методом [10]. Выделенную ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции, и оценивали примерную длину генома фага.

Секвенирование проводили методом пиросиквенса на приборе FLX Roche (Roche Biosciences).

Анализ последовательностей вели с помощью программного пакета Lsergene Dtr.

Результаты и обсуждение Выделенный бактериофаг phiKT отличается типичной для подовирусов морфологией [9]. Диаметр его капсида составляет около 55 нм (рис. 1), что позволило оценить размер его генома как примерно 40 т. п. н. (по сходству с бактериофагом Т7 [2]), и считать геном линейным и состоящим из дцДНК. При суммировании длин фрагментов генома, полученных гидролизом рестриктазами EcoRV и spI, это предположение было подтверждено. При секвенировании геномной ДНК была получена последовательность длиной 4208 п. н. Посредством компьютерной симуляции положений сайтов гидролиза рестриктазами было определено ориентировочное местоположение физических концов генома, при этом результаты практического рестрикционного анализа полностью совпали с предсказанными по последовательности результатами. Полученная нуклеотидная последовательность была депонирована в GenBnk под номером _015920.

Рис. 1 - Бактериофаг phiKT и бактериофаг Т7 для сравнения (трансмиссионная электронная микроскопия, х40000, контрастирование молибдатом аммония, масштаб – 100 нм).

Дальнейший биоинформатический анализ позволил установить тонкую структуру генома бактериофага phiKT (рис. 2).

Всего нами была обнаружена 31 открытая рамка считывания (см. аннотацию, GenBnk _015920), причём необычным оказалось то, что все эти рамки находились только в прямой ориентации относительно начала генома.

Методом сравнения с базами последовательностей регуляторных элементов (программы BROM (http://linux1.softerry.com/erry.phtml?topic=prom&group=progrms&sugroup=gf ind) и РРР (http://ioinformtics.iol.rug.nl/wesoftwre/ppp/ppp_strt.php)) нами были предсказаны сайт связывания сигма-А субъединицы РНК-полимеразы E. coli в самом начале генома (координаты 9-12), промоторный участок (1924-194), и сайт связывания регуляторного белБиология фагов Рис. 2 - Карта генома бактериофага phiKT ка fis (1950-1957), находящийся в зоне промотора. Таким образом, можно сказать, что начальная фаза экспрессии генома фага phiKT скорее всего целиком зависит от клеточных факторов и ферментов. Ранние гены фага представлены модулем обмена нуклеиновых кислот, и кодируют ферменты и белки, необходимые фагу для переключения синтетических процессов клетки на репликацию фагового генома – праймазу, хеликазу, ДНК-фосфатазу, белок инициации репликации, ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, набор эндо- и экзонуклеаз, dM-киназу, ДНКзависимую РНК-полимеразу, и несколько белков с неустановленной функцией. Этот модуль, занимающий в геномной карте позиции с 2105 по 15330 (31% размера генома), заканчивается достаточно длинным спейсерным участком (15330-1895, 155 п. н.), лишённым открытых рамок считывания. В этом участке, однако, нам удаётся предсказать существование второго промоторного участка (позиции 1401-1450, программа (http://www.fruitfly.org/seq_ tools/promoter.html)), предположительно ассоциированного с экспрессией второго геномного модуля (координаты 1895-3093, 43% генома). Этот модуль содержит гены фаговых белков, необходимых для построения вириона (hed-til белок, scffold-белок, основной белок капсида, белки трубки хвоста (А и В), внутренний белок вириона, белок слияния мембран, белок хвостовой фибриллы), и для упаковки генома фага в капсид (белок ДНК-матураза В). Этот модуль, равно как и предыдущий, обращает на себя внимание высокой плотностью генов – в нём практически отсутствуют межгенные участки, что дополнительно свидетельствует о наиболее вероятной транскрипции этого модуля как единого целого фаговой РНК-полимеразой, кодируемой в первом модуле [1]. Дополнительным подтверждением этой гипотезы можно считать исБиология фагов чезновение чувствительности фаговой инфекции к блокированию клеточной РНК-полимеразы E. i рифампицином, начиная с 10 минуты инфекции (данные не приведены).

Непосредственно за этим модулем следует короткий (3093-3780, 87 п. н.) спейсер, в котором не удаётся предсказать промоторных и регуляторных элементов. Далее располагаются поздние гены, кодирующие белки, ассоциированные с лизисом клетки хозяина (эндолизин, трансмембранный белок, холин). Интересно то, что уже за геном холина – ближе к физическому концу генома фага – обнаруживаются ещё две рамки считывания, также прямые, и кодирующие белок неизвестной функции и белок, сходный с белком-рулеткой (tpe mesure protein) фагов семейства iviid. Роль второго белка у лямбда-подобных вирусов состоит в инициации полимеризации хвоста фага, и определении его физической длины [7]. Для установления функции данного белка в физиологии фага phiKT необходим протеомный анализ зрелого вириона. До получения данных о белках, входящих в структуру зрелой вирусной частицы, остаётся только догадываться о роли гомолога белка, необходимого сифовирусам, для фактически лишённого хвоста подовируса.

При анализе последовательностей открытых рамок считывания генома фага phiKT методом транслирующего поиска гомологий BLTX (http://lst.nci.nlm.nih.gov/) была выявлена очень высокая степень гомологии ряда важнейших генов (хеликазы, ДНК-полимеразы, 5’-3’ экзонуклеазы, РНК-полимеразы, всех структурных белков) и генов с неустановленными Рис. 3 - Dot-pot матрица геномов фагов phiKT и Cd1. Координаты соответствуют геномным координатам. Внизу цифрами и серыми линиями указаны примерные границы модулей генома, чёрными отрезками над ними – зоны максимальной нуклеотидной гомологии.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Материалы VI-й Международной студенческой научной конференции, посвящённой 70-летию ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина 14 – 15 мая 2013 года Часть I Ульяновск – 2013 Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО...»

«НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Материалы VI-й Международной студенческой научной конференции, посвящённой 70-летию ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина 14 – 15 мая 2013 года Часть II Ульяновск – 2013 Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО...»

«Уважаемые участники конференции! От имени Дальневосточного государственного технического рыбохозяйственного университета я рад приветствовать вас на очередной Международной научно-технической конференции Актуальные проблемы освоения биологических ресурсов Мирового океана. Я уверен, что в ходе работы мы сможем обсудить множество актуальных тем: совершенствование существующих технологий, нахождение путей оптимизации эксплуатации биоресурсов, исчезновение некоторых видов рыб, а также многие другие...»

«Уважаемые коллеги! Миркин Б.М., д.б.н., профессор, Башкирский Оргкомитет планирует опубликовать научные гос. университет материалы конференции к началу ее работы. Приглашаем Вас принять участие в работе П е н ч у ко в В. М., а к а д е м и к РАСХ Н, Для участия в работе конференции Международной научной конференции необходимо до 1 февраля 2010 года Ставропольский гос. аграрный университет Теоретические и прикладные проблемы П е т р о в а Л. Н., а к а д е м и к РА С Х Н, н ап р а в и т ь...»

«UNEP/CBD/COP/7/21 Страница 112 Приложение РЕШЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ СЕДЬМЫМ СОВЕЩАНИЕМ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Решение Страница VII/1. Биологическое разнообразие лесов 114 VII/2. Биологическое разнообразие засушливых и субгумидных земель VII/3. Биологическое разнообразие сельского хозяйства 114 VII/4. Биологическое разнообразие внутренних водных экосистем 114 VII/5. Морское и прибрежное биологическое разнообразие 160 VII/6. Процессы проведения оценок 114 VII/7. Оценка...»

«01 – 31 августа 2013 2013 Содержание Общие тенденции инновационной сферы Биотехнологии Медицина и здравоохранение Новые материалы и нанотехнологии Транспортные и космические системы Рациональное природопользование Энергоэффективность и энергосбережение Список источников 2 Общие тенденции инновационной сферы Российские ученые создают искусственное человеческое тело Российские ученые приступили к разработке протеза всего человеческого тела. Об этом в ходе пресс-конференции заявил профессор МГУ,...»

«Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Студенческий союз МГУ Биологический факультет ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ XIII МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ ЛОМОНОСОВ-2006 12–15 апреля 2006 г. Секция Биология Москва – 2006 УДК 57 Председатель оргкомитета секции Биология Проф. Гостимский С.А. Члены оргкомитета: С.н.с. Ботвинко И.В. Проф. Максимов Г.В. Доц. Медведева М.В. Проф. Соколов Д.Д. Проф. Онищенко Г.Е. С.н.с. Авилова К.В. Ст. преп. Сергеев И.Ю. Доц....»

«Известия Коми научного центра УрО РАН Выпуск 3(15). Сыктывкар, 2013. ХРОНИКА ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЕ ЭКОСИСТЕМ КРАЙНЕГО СЕВЕРА: ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ, МОНИТОРИНГ, ОХРАНА С 3 по 7 июня 2013 г. в г. Сыктывкар (Республика Коми) состоялась Всероссийская научная конференция Биоразнообразие экосистем Крайнего Севера: инвентаризация, мониторинг, охрана. Инициатор ее проведения – Институт биологии Коми НЦ УрО РАН. Соучредителями выступили Министерство природных ресурсов и охраны...»

«Труды VI Международной конференции по соколообразным и совам Северной Евразии ОСЕННЯЯ МИГРАЦИЯ СОКОЛООБРАЗНЫХ В РАЙОНЕ КРЕМЕНЧУГСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА М.Н. Гаврилюк1, А.В. Илюха2, Н.Н. Борисенко3 Черкасский национальный университет им. Б. Хмельницкого (Украина) 1 gavrilyuk.m@gmail.com Институт зоологии им. И.И. Шмальгаузена НАН Украины 2 ilyuhaaleksandr@gmail.com Каневский природный заповедник (Украина) 3 mborysenko2905@gmail.com Autumn migration of Falconiformes in the area of Kremenchuh...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/WG-ABS/2/2 16 September 2003 РАЗНООБРАЗИИ RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH СПЕЦИАЛЬНАЯ РАБОЧАЯ ГРУППА ОТКРЫТОГО СОСТАВА ПО ДОСТУПУ К ГЕНЕТИЧЕСКИМ РЕСУРСАМ И СОВМЕСТНОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ВЫГОД Второе совещание Монреаль, 1-5 декабря 2003 года Пункты 3, 4, 5, 6 и 7 предварительной повестки дня* ДАЛЬНЕЙШЕЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕУРЕГУЛИРОВАННЫХ ВОПРОСОВ, КАСАЮЩИХСЯ ДОСТУПА К ГЕНЕТИЧЕСКИМ РЕСУРСАМ И СОВМЕСТНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЫГОД: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕРМИНОВ, ДРУГИЕ...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКО UNEP/CBD/COP/8/11/Rev.1 2 February 2006 М РАЗНООБРАЗИИ RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20–31 марта 2006 года Пункт 12 предварительной повестки дня * ДОКЛАД ИСПОЛНИТЕЛЬНОГО СЕКРЕТАРЯ ОБ АДМИНИСТРАТИВНОМ ОБЕСПЕЧЕНИИ КОНВЕНЦИИ И БЮДЖЕТЕ ЦЕЛЕВЫХ ФОНДОВ КОНВЕНЦИИ Записка Исполнительного секретаря ВВЕДЕНИЕ 1. На своем седьмом совещании Конференция Сторон в пункте 28...»

«Российская академия наук Институт озероведения РАН Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена Гидробиологическое общество РАН II Международная конференция Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем 10-14 октября 2011г., Санкт-Петербург ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ II International Conference Bioindication in monitoring of freshwater ecosystems 10-14 October 2011, St.-Petersburg, Russia ABSTRACTS При поддержке: Отделения наук о Земле РАН, СПб Научного Центра РАН, РФФИ...»

«Учреждение образования Брестский государственный университет имени А.С. Пушкина Мониторинг окружающей среды Сборник материалов II Международной научно-практической конференции Брест, 25–27 сентября 2013 года В двух частях Часть 1 Брест БрГУ имени А.С. Пушкина 2013 2 УДК 502/504:547(07) ББК 20.1 М77 Рекомендовано редакционно-издательским советом учреждения образования Брестский государственный университет имени А.С. Пушкина Рецензенты: доктор геолого-минералогических наук, профессор М.А....»

«Международная научно-практическая конференция МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ: ПРОШЛОЕ, НАСТОЯЩЕЕ И БУДУЩЕЕ 26 МАЯ 2014Г. Г. УФА, РФ ИНФОРМАЦИЯ О КОНФЕРЕНЦИИ ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ КОНФЕРЕНЦИИ Цель конференции: поиск решений по актуальным проблемам современной наук и и Клиническая медицина. 1. распространение научных теоретических и практических знаний среди ученых, преподавателей, Профилактическая медицина. 2. студентов, аспирантов, докторантов и заинтересованных лиц. Медико-биологические науки. 3. Форма...»

«Камчатский филиал Тихоокеанского института географии (KФ ТИГ) ДВО РАН Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО) Биология Численность Промысел Петропавловск-Камчатский Издательство Камчатпресс 2009 ББК 28.693.32 Б90 УДК 338.24:330.15 В. Ф. Бугаев, А. В. Маслов, В. А. Дубынин. Озерновская нерка (биология, численность, промысел). Петропавловск-Камчатский : Изд-во Камчатпресс, 2009. – 156 с. В достаточно популярной форме представлены научные данные о...»

«ФГБОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновская МОО Ассоциация практикующих ветеринарных врачей АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции 25 – 26 апреля 2012 года Ульяновск – 2012 Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии УДК 631 Актуальные проблемы инфекционной...»

«АССОЦИАЦИЯ СПЕЦИАЛИСТОВ ПО КЛЕТОЧНЫМ КУЛЬТУРАМ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ISSN 2077- 6055 КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ ВЫПУСК 27 CАНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2011 ISSN 2077- 6055 УДК 576.3, 576.4, 576.5, 576.8.097, М-54 Клеточные культуры. Информационный бюллетень. Выпуск 27. Отв. ред. М.С. Богданова. - СПб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2011. - 94 с. Настоящий выпуск содержит информацию об основных направлениях фундаментальных и прикладных исследований на клеточных культурах, о...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/10/18 23 August 2010 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Десятое совещание Нагоя, Япония, 18-29 октября 2010 года Пункт 4.9 повестки дня ПРИВЛЕЧЕНИЕ К РАБОТЕ СУБЪЕКТОВ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И ОСНОВНЫХ ГРУПП И УЧЕТ ГЕНДЕРНОЙ ПРОБЛЕМАТИКИ Записка Исполнительного секретаря ВВЕДЕНИЕ I. Эффективное осуществление Конвенции зависит от участия и привлечения к работе 1. субъектов деятельности и коренных и местных общин. Об этом...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/3 РАЗНООБРАЗИИ 19 December 2005 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20-31 марта 2006 года Пункт 9 предварительной повестки дня* ДОКЛАД О РАБОТЕ ОДИННАДЦАТОГО СОВЕЩАНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ОРГАНА ПО НАУЧНЫМ, ТЕХНИЧЕСКИМ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ КОНСУЛЬТАЦИЯМ СОДЕРЖАНИЕ Страница ПУНКТ 1 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ ПУНКТ 2 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ...»

«Институт систематики и экологии животных СО РАН Териологическое общество при РАН Новосибирское отделение паразитологического общества при РАН ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ТЕРИОЛОГИИ 18–22 сентября 2012 г., Новосибирск Тезисы докладов Новосибирск 2012 УДК 599 ББК 28.6 А43 Конференция организована при поддержке руководства ИСиЭЖ СО РАН и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 12-04-06078-г) Редакционная коллегия: д.б.н. Ю.Н. Литвинов...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.