WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«Том I Ульяновск - 2013 Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 4 ] --
Македонова Л.Д., кандидат медицинских наук, тел. 8(863)240-27-03, e-mail:plague@aaanet.ru Кудрякова Т.А., доктор медицинских наук, Тел. 8 (863)240-27-03, e-mail:plague@aaanet.ru Качкина Г.В., Тел. 8(863)240-27-03, e-mail:plague@aaanet.ru Гаевская Н.Е., Тел. 8(863)240-27-03, e-mail:gaevskaya.nata@mail.ru ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора Ключевые слова: бактериофаги Y.dbi, Y.nii, обнаружение, свойства Подобраны 4 индикаторных псевдотуберкулезных и 5 кишечноиерсиниозных штаммов, при применении которых выделены 12 псевдотуберкулезных и 9 кишечноиерсиниозных фагов. При идентификации бактериофагов установлена специфичность антигенного строения, различия в морфологии негативных колоний и фаговых частиц, по диапазону литической активности. Чувствительность к фагам может быть использована в лабораторной диагностике штаммов Y.dbi и Y.nii.

Введение. Заболевания, вызываемые патогенными иерсиниями, в последние годы занимают важное место среди других острых кишечных инфекций. Ежегодно в России регистрируются в основном в организованных детских коллективах вспышки псевдотуберкулеза. Существенно возросло значение Y.nii в возникновении гастроинтестинальной инфекции [1, 2]. Сложность идентификации и дифференциации инфекций, вызванных этими микроорганизмами, связана с фенотипической и генотипической близостью возбудителей. ПоБиология фагов этому лабораторная диагностика иерсиниозов с использованием специфических бактериофагов в последние годы привлекает все большее внимание микробиологов [3, 4]. Накопление данных о новых псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных фагах, изучение их биологических свойств не теряет своей актуальности.

Целью настоящей работы явилось выделение и идентификация новых псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных бактериофагов из штаммов различных О-сероваров.

Материалы и методы исследований. В экспериментах использовали 11 штамм псевдотуберкулезного микроба О1-О5 сероваров и 227 штаммов Y.nii сероваров 1-38, выделенных в различные годы и полученных из музея института. Специфичность свежевыделенных фагов оценивали на 44 штаммах различных представителей семейства Enbi. Исследовали также пробы сточных вод г. Ростова – на – Дону на наличие кишечноиерсиниозных бактериофагов, которые выявляли в надосадочных жидкостях суточных бульонных культур Y.dbi и Y.nii и пробах сточных вод, инактивированных хлороформом, двухслойным методом по Грациа. В качестве индикаторов испытывали каждый из исследуемых штаммов Y.dbi и Y.nii. Биологические свойства изучали по общепринятым методам [5]. Литическую активность исследовали постановкой прямой пробы с фагами [5]. Специфические антифаговые сыворотки получали путем внутривенной иммунизации кроликов препаратами свежевыделенных фагов с различной морфологией корпускул в возрастающих дозах. В качестве питательных сред использовали 0,7% и 1,5% агар, бульон Хоттингера и 1,5% эритрит агар (для обнаружения псевдотуберкулезных фагов), рН всех сред 7,2.

Результаты исследований и их обсуждение. В результате проделанной работы установлено, что эффективными индикаторными свойствами для выделения 12-ти псевдотуберкулезных фагов из гомологичных культур О1, О3, О4, О5 сероваров обладали следующие штаммы: 132 (О1 серовара), 310, 5344 (О3 серовара), 1038 (О4 серовара, культура депонирована в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под № КМ 207). Из штаммов Y.nii в качестве индикаторных отобраны следующие: Y.nii 2012 (депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под № КМ 20) и (О3 серовара), 10152 (О5 серовара), 5517 (О10 серовара) и 5528 (О18 серовара), использование которых позволило изолировать 7 фагов из штаммов наиболее часто встречающихся О-сероваров Y.nii (О1, О3, О5, О12). Из проб сточных вод выделено 2 фага.

Свежевыделенные псевдотуберкулезные фаги имели сходное строение фаговых корпускул и относились к III морфологической группе по классификации А.С.Тихоненко []. Диаметр негативных колоний составлял 4- мм. Фаги полностью нейтрализовались антифаговой сывороткой к псевдотуберкулезным фагам I серотипа и не давали перекрестных реакций с антифаговыми сыворотками к псевдотуберкулезным фагам II-III серотипов и чумным фагам I-IV серотипов. Псевдотуберкулезные бактериофаги обладали широким спектром литической активности, лизируя 50-100% штаммов Y.dbi, а также взятые в опыт штаммы E.i,.dni,.i и 2,-20,5% штаммов Y.nii. Изучение диапазона действия выделенных псевдотуберкулезных фагов на штаммах Y.dbi разных О-сероваров показало, что они отличаются друг от друга (табл.1). Однако избирательной активности фагов в отношении псевдотуберкулезных штаммов определенных О - серогрупп не отмечено.

Изученные фаги Y.nii характеризовались разнообразием биологических свойств по строению вирионов, антигенной структуре, спектру литической активности. Морфологическая структура исследованных фагов Y.nii была представлена III, IV, V группами по классификации А.С.Тихоненко. Кишечноиерсиниозные фаги имели 3 типа неБиология фагов гативных колоний: 1) точечные, мутные и полупрозрачные; 2) мутные, диаметром около 1мм;

3) крупные мутные с ореолом, диаметром 3-4мм. Выявлено 3 серологических типа фагов Y.nii, не дающие перекрестных реакций. Не отмечено антигенного родства между псевдотуберкулезными и кишечноиерсиниозными бактериофагами.

Результаты, полученные при изучении спектра литической активности 9-ти фагов Y.nii, выявили специфичность 7 из них. Они не лизировали представителей других видов семейства Enbi. Два фага проявляли активность в отношении некоторых штаммов ig, mn и E.i. Диапазон литической активности кишечноиерсиниозных фагов в отношении гомологичных штаммов колебался от 3,08 до 31,7%. Исключение составляли фаг 19 (из сточных вод), который лизировал,07% гомологичных штаммов и фаг 5423, активный в отношении 0,88% исследованных штаммов Y.nii.



Таблица 1 - Лизабельность штаммов Y.pseudotuberculosis разных сероваров псевдотуберкулезными фагами Y.pseudotuberculosis С/ры изучен.

Кол-во изуч.

Примечание: Л – лизабельность штаммов, с/в - серовар Заключение. Таким образом, с помощью специально подобранных четырех индикаторных штаммов Y. dbi и пяти Y.nii удалось обнаружить 12 новых псевдотуберкулезных и 9 кишечноиерсиниозных бактериофагов. Коллекция бактериофагов и тест-штаммов патогенных для человека иерсиний представлена в базе данных (свидетельство о государственной регистрации № 201220588 от 19 июня 2012 года). Выделенные псевдотуберкулезные фаги не отличались друг от друга по морфологии негативных колоний на газонах соответствующих индикаторных культур и имели одинаковое строение корпускул. Фаги относились к 1 серологической группе псевдотуберкулезных фагов. Отмечена способность фагов Y. dbi одновременно лизировать чумные и псевдотуберкулезные культуры, а также отдельных представителей семейства Enbi.

Фаги Y.nii формировали на газонах чувствительных культур 3 типа негативных колоний, отличающихся степенью прозрачности и диаметром. По структуре вирионов они относились к трем морфогруппам и по антигенным свойствам составили 3 серогруппы.

Отмечены индивидуальные особенности псевдотуберкулезных и кишечноиерсиниозных фагов в диапазоне литической активности, которые могут быть использованы в лабораторной диагностике.

1. Ющук Н.Д. Иерсиниозы /Н.Д.Ющук, Г.Я.Ценева, К.Н.Кареткина и др. –М., 2003, 20с.

2. Профилактика инфекционных болезней. Кишечные инфекции. Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза /Ю.В.Демина, Г.Я.Ценева, Е.А.Воскресенская и др. //Методические указания. – М., 2009, с.

3. Проценко С.Л. Биологические свойства возбудителя кишечного иерсиниоза из очагов чумы Кавказа и Закавказья //Автореф. дисс…канд. мед. наук. – Саратов, 1990.

4. Дарсавелидзе М.А., Капанадзе Ж.С., Чанишвили Т.Г. Биологические свойства бактериофагов, активных в отношении Yersini enterocolitic//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол., 2004, №, с.10-13.

5. Адамс М. Бактериофаги: Пер. с англ. – М., 191, 527с.

. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. – М., 198, 89с.

BIOLOGICAL PROPERTIES OF PHAGES PATHOGENIC IYERSINY:

YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS AND YERSINIA ENTEROCOLITICA

Makedonskaya L.D, Kudryakova T.A., Kachkina G.V., Gaevskaya N.E.

Key words: big Y.dbi, Y.nii, din, i 4 indi d-b nd 5 kiniinizn in d iin f wi 12 d-b nd 9 kiniinizn g d. A idnifiin f big ifii f n ni-gn, diinin in mg f ngiv ni nd fgv i, n ng f i ivi i bid. niivi g n b d in b digni f in Y.dbi и Y.nii.

УДК 619:

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАГОВ ESCHERICHIA COLI

О157 ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА

Молофеева Н.И., кандидат биологических наук, доцент 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Золотухин С.Н., доктор биологических наук, профессор тел. 8(8422) 55-95-47, fvm.zol@yandex.ru ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

Ключевые слова: Бактерии, бактериофаги, энтеробактерии, литическая активность, специфичность.

Работа посвящена выделению и изучению основных биологических свойств бактериофагов бактерий Eii i О157. При проведении исследований авторами выделено штамма фага и изучены их биологические свойства.

Биология фагов Введение. В последние годы установлено, что штаммы Е. соi серологического варианта 0157 способны вызывать у людей тяжело протекающие вспышки гастроэнтерита [7, 8, 9, 13, 14], а и у молодняка животных диареи с признаками геморрагического гастроэнтеритах[11].

Эффективность лечебных мероприятий во многом зависит от своевременности диагностики болезни, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики указанной инфекции уделяется большое внимание. Для бактериологической диагностики разработаны питательные среды для выделения указанного серовара эшерихий [10]. Но метод их выделения и идентификации с использованием предлагаемых сред сравнительно трудоемок, не достаточно чувствителен и требует много времени (4-5 суток). Современные методы иммунодиагностики (ПЦР и ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов, для постановки этих реакций, делает их пока недоступными для большинства лабораторий. Поэтому перед нами была поставлена цель - изыскание более простого и доступного для любых лабораторий метода индикации и идентификации названных микроорганизмов.

В микробиологической практике для ускоренного обнаружения некоторых микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды предложены индикаторные бактериофаги [3, 5, ] Метод индикации и идентификации патогенных микроорганизмов с помощью бактериофагов специфичен, не требует больших затрат времени, материалов и общедоступен.





В связи с отсутствием сообщений в научной литературе об использовании бактериофагов Е. соi О157 возникла необходимость изыскания индикаторных эшерихиозных бактериофагов для ускоренного обнаружения серологического варианта 0157 в объектах внешней среды, патологическом материале, пищевых продуктах и кормах, а также для ускоренного типирования полевых штаммов возбудителя болезни.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследований служили сточные воды, взятых из животноводческих ферм и общественных туалетов разных населенных пунктов Ульяновской и Самарской областей. Использовались бактериологические, вирусологические методы исследования. Методы выделения бактериофагов и работы с ними [1, 2, 4].

Методы селекции бактериофагов.

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы целью наших исследований была разработка оптимальной схемы выделения фагов Е.соi 0157.

В основу метода для поиска фагов положена схема, предложенная Грациа, адаптированная к изучаемым видам бактерий. 1,5% МПА с генцианвиолетом накануне опыта разлили по чашкам в количестве 25-30 мл. Чашки, прикрытые стерильной бумагой, высушивали под бактерицидной лампой в течение нескольких часов, затем закрывали крышками и в перевернутом виде оставляли на ночь при комнатной температуре для полного высушивания агара в чашках, так как малейшее увлажнение искажает результаты. Предварительно разлитый в пробирку 0,7% агар в количестве 2,5 мл доводили до 4-47°С и 1 мл исследуемого фильтрата вносили в 2,5 мл 0,7% агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры Е.соi, вращая пробирку для быстрого перемешивания все быстро перемешивали и выливали на поверхность агара. В качестве индикаторной культуры использовали штаммы Е.соi 0157.

Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности 1,5% агара, для затвердения оставляли на столе в течение 30 минут, а затем выдерживали в термостате при 37°С в течение 20-24 часов. При наличии фага на чашках обнаруживали негативные колонии или зоны лизиса.

По указанной схеме нами было исследовано 5 проб сточных вод, взятых из животноводческих ферм и общественных туалетов разных населенных пунктов Ульяновской и Самарской областей. Из трех проб было выделено 3 штамма фага, которые дифференцировали по морфологии негативных колоний (таблица 1).

Таблица 1 - Морфология негативных колоний фагов Для селекции клонов фагов отвивали одну негативную колонию и помещали в пробирку с МПБ и индикаторной культурой эшерихий. Пробирки инкубировали в термостате при 37°С в течение 5- часов, прогревали при 0°С и полученный фаголизат вновь исследовали методом агаровых слоев. Каждый штамм пассировали 7-10 раз до получения рассы колифага с однородными негативными колониями.

Селекционированные бактериофаги имели прозрачные негативные колонии с ровными краями диаметром 1,0-2,0 мм.

Биологические свойства этих фагов были изучены по ряду показателей, в том числе активности и специфичности.

Литическую активность селекционированных фагов мы определяли на плотных и жидких питательных средах на индикаторных культурах E.i по следующей методике: в ряд пробирок из нейтрального стекла одинакового диаметра наливали по 4,5 мл МПБ. В первую вносили 0,5 мл испытуемого фага. Затем делали последовательные разведения 1:10. Обычно использовали 10 пробирок. Затем во все пробирки вносили по 0,2 мл 18-часовой индикаторной бульонной культуры Е.соli 0157, причем 11-я и 12-я пробирки являются контрольными, в первой из них находится МПБ и культура (без фага), во второй - один МПБ (контроль на стерильность). Все пробирки помещали в термостат при 37°С на 18 часов. Титр фага устанавливали по конечному разведению.

При использовании метода агаровых слоев определены качественные показатели фагов. Для опыта брали по 1 мл фага в разведениях 10 до 1010 (без культуры) и вносили в пробирки с 2,5 мл 0,7% агара, расплавленного и остуженного до 4-47°С, туда же вносили 0,2 мл культуры Е.соli, содержимое пробирки перемешивали и выливали на поверхность 1,5% агара.

Чашки оставляли на столе для затвердения агара, затем их выдерживали в термостате при 37°С в течение 20 часов. Активность определяли по количеству негативных колоний на газоне роста индикаторных культур.

Таблица 2 - Результаты изучения литической активности эшерихиозных фагов активность Для изучения специфичности фагов нами были использованы штаммов бактерий Е.соi гетерологичных серологических групп, в том числе 3 штамма, относящиеся к серогруппе О157, Cib - 2 штамма, М.mgnii - 2 штамма, Kbi - 1 штамм.

Биология фагов Таблица 3 - Специфичность фагов Заключение. Анализируя результаты проведенных исследований по изучению литической активности и специфичности, селекционированные нами фаги обладают высоким спектром литической активности по Аппельману - 10--10-7; по Грациа – от 3,2х109 до 8х109, и являются специфичными по отношению к бактериям Eii i О157. Селекционированные бактериофаги являются новыми объектами, дальнейшее изучение которых представляет определенный интерес.

1. Адамс М. Бактериофаги (перевод с англ.)//М., 191.-521 С.

2. Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии// Учебное пособие, Ульяновск. -1988. -45 С.

3. Ганюшкин В.Я. Обследование свиней на носительство сальмонелл и фагопрофилактика.// Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Ульяновск.-1990. с. 20-28.

4. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия.// М.: Медгиз., 191. -297С.

5.Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Васильев Д.А. Бактерии рода itrocter и их бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов. Ульяновск. – 2000, с..53-58.

.Кольпикова Т.Н., Бакулов И.А., Котляров В.М. Фаготипирование листерий. /Ветеринария., 1990, с. 31-32.

7. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Перспективы практического применения листериозных бактериофагов.//Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии./ Материалы научной конференции ВНИИВиМ. Покров. Часть 11, 1992, с.

211-212.

8. Потапова Т.А. и др. О выделении Е. coli О157:Н7 -возбудителя ОКИ с гемолитикоуремическим синдромом в Тульской области // ЖМЭИ, №5, 2000, с. 115-11.

9. Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М.// Микробиология. №2, 1998, с.87-5.

10. Султанова З.С. и др. //ЖМЭИ, №1, 2000, с. 48-50.

11. Малов В.А., Пак С.Г.// ЖМЭИ, №2, 199, с. 50-53.

12. Характеистика биологических свойств бактериофагов вида Bcillus sutilis / Д.А.

Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 79- 13. Воусе Т.G., werdlov D.L., Griffin P.M..// ew Епgl. J. Меd., V. 333, 1995, р. 34-38.

14. http://www.ecdc.europ.eu.

BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF PHAGES ESCHERICHIA COLI

О157 TO CREATE DIAGNOSTIC PREPARATION

Моlofeeva N.I., Vasilev D.А., Zolotukhin S.N.

Кey words: Bi, big, nbi, i ivi nd ifii.

g nd did i bigi i.

УДК 578.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГА AP22, СПЕЦИФИЧЕСКИ

ИНФИЦИРУЮЩЕГО ШИРОКИЙ СПЕКТР ШТАММОВ

ACINETOBACTER BAUMANNII

Попова А.В., кандидат биологических наук, popova_nastya86@mail.ru Богун А.Г., кандидат биологических наук, bogun62@mail.ru Воложанцев Н.В., кандидат биологических наук, nikvol@obolensk.org ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора Ключевые слова: бактериофаг, Ainb bmnnii, геномный анализ.

Данная работа посвящена микробиологической и молекулярно-генетической характеристике вирулентного бактериофага, специфически инфицирующего и лизирующего широкий спектр клинических штаммов A. bmnnii.

Введение. Одним из наиболее значимых возбудителей внутрибольничных инфекций во всем мире является представитель группы неферментирующих грамотрицательных аэробных бактерий – Ainb bmnnii, который характеризуется резистентностью к большинству доступных на сегодняшний день антибиотиков, дезинфектантов, устойчивостью к УФ-облучению и высушиванию, способностью к образованию биопленок на различных биотических и абиотических поверхностях. Инфекции, вызываемые A. bmnnii, представляют серьёзную терапевтическую проблему, особенно у иммунокомпрометированных больных ожоговых отделений, отделений реанимации и интенсивной терапии, где A. bmnnii часто становится причиной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций, постхирургических осложнений, бактериемий, септицемий, сепсиса (eleg et l., 2008; Towner, 2009).

В связи с этим существует острая проблема поиска и разработки новых антибактериБиология фагов альных средств, активных в отношение A. bmnnii. Применение литических бактериофагов – один из возможных путей решения данной проблемы. Однако в настоящее время, как в нашей стране, так и за рубежом, не существует препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных A. bmnnii-инфекций. Это связано, в первую очередь, с отсутствием коллекций перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для разработки лечебных препаратов, а также с узким спектром антибактериальной активности известных литических фагов, инфицирующих A. bmnnii.

Материалы и методы исследований.

В работе использовали 130 штаммов A. bmnnii, выделенных из клинического материала от госпитализированных больных в стационарах различного профиля городов Челябинска (n = 89), Нижнего Новгорода (n = 20), Москвы (n = 12), Санкт-Петербурга (n = 9) в 2005гг., а также бактерии других геномовидов Ainb (n = 18) и бактерии других родов и семейств: Pdmn gin (n = 5), Eii i (n = 3), Yini dbсi (n = 3), Yini nii (n = 3), Kbi nmni (n = 3), Kbi x (n = 3), Enb (n = 3), P mid (n = 3) и mn Enteritidis (n = 3), полученные из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии СГМА г. Смоленска и «ГКПМОболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Выделение бактериофагов, лизирующих бактерии рода Ainb, из образцов клинического материала и проб из окружающей среды, а также наработку, очистку и концентрирование фаголизата проводили, как описано ранее (opov et l., 2012).

Для изучения спектра литической активности и биологических свойств бактериофага использовали методы, предложенные М. dms (1959), с нашими модификациями (Попова и др., 2012, Durovin et l., 2012, opov et l., 2012).

ДНК бактериофагов выделяли методом депротеинизации очищенных в градиенте хлористого цезия фаговых частиц с использованием лизирующей смеси, содержащей 0,5 % D, Рис. 1 – Зоны лизиса бактериального «газона» штамма A. mii 1053, формируемые фагом AP22 на плотной питательной среде: A. Морфология негативных колоний фага с ореолами; Б. Пятно лизиса бактериофага, окружённое ореолом (наверху: через 18 ч инкубации при температуре 37 С, внизу – через 30 ч последующего хранения при температуре 4 С) 20 мМ ЭДТА и 50 мкг/мл протеиназы К. ДНК экстрагировали смесью фенол/хлороформ (1:1) и переосаждали этиловым спиртом с ацетатом натрия.

Секвенирование ДНК проводили по методу Сэнгера на приборах BI RIM (pplied Bioystem, США) и MegBce (mershm Biosciences, США) с программным обеспечением imrron 3.12.

Результаты исследований и их обсуждение.

В ходе анализа образцов клинического материала и проб из окружающей среды, был выделен бактериофаг, получивший авторское название AP22, обладающий широким спектром антибактериального действия по отношению к клиническим штаммам A. bmnnii.

На культуре чувствительных бактериальных штаммов A. bmnnii бактериофаг AP формирует круглые прозрачные негативные колонии с ровными краями, окружённые непрозрачными ореолами, которые увеличиваются в размере с течением времени (рис.1). В соответствии с морфологическими параметрами, согласно Международной классификации и таксономии вирусов, бактериофаг AP22 отнесен к семейству Mviid, морфотипу А1 (opov et l., 2012).

Бактериофаг 22 лизирует в общей сложности 8 % (89 из 130) клинических штаммов A. bmnnii и не обладает литической активностью по отношению к представителям других геномовидов Ainb, а также бактериям других родов и семейств (Попова и др., 2012).

В экспериментах по определению времени адсорбции и одиночного цикла размножения бактериофага AP22 показано, что более 99 % фаговых частиц адсорбируются в течение 5 мин, длительность латентного периода составляет 40 мин, средний выход фаговых частиц в расчёте на одну инфицированную бактериальную клетку составляет 240 частиц, что свидетельствует о высокой урожайности исследуемого фага (opov et l., 2012).

При изучении динамики инфекционного процесса фага AP22, установлено, что при значениях множественности инфицирования (MOI), составляющих 50 и пять фаговых частиц на одну бактериальную клетку, бактериофаг полностью лизирует жидкую культуру штаммахозяина через 0 мин после начала фаговой инфекции, в то время как при MOI=0,5 лизис происходит через 2 ч.

На сегодняшний день многие вопросы, связанные с практическим использованием бактериофагов, могут быть решены на стадии изучения фагового генома: это и тип развития фага, и наличие генов, кодирующих потенциально опасные продукты, устойчивость к антибиотикам и т.д. Поэтому одна из задач наших исследований предусматривала определение полной нуклеотидной последовательности бактериофага 22. Секвенирование нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием метода Сэнгера. Геном бактериофага содержит 4387 п.н. с Г-Ц составом 37,74 %.

С помощью биоинформационных программ GeneMrk.hmm и oft-Berry FGEE в геноме фага 22 было выявлено 89 открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих предполагаемые пептиды размером не менее 35 а.о., из которых 77 ОРС располагаются на прямой, 12 – на обратной цепях ДНК.

При сравнении аминокислотных последовательностей потенциальных белков фага 22 с известными протеинами с помощью BLT, определены возможные функции 25 % (22 из 89) из них; 0 % (54 из 89) ОРС кодируют гипотетические белки с неизвестными функциями, представленные в базах данных; предполагаемые продукты 15 % ОРС (13 из 89) не имеют сходства с какими-либо фаговыми или бактериальными протеинами. Показано, что 18 % ( из 89) ОРС 22 кодируют полипептиды, обладающие гомологией с протеинами Ainb spp. с неизвестной функцией, 57 % (51 из 89) ОРС гомологичны фаговым протеинам.

Биология фагов Сравнительный геномный анализ выявил существенную гомологию между бактериофагом 22 и фагом B1 (Yng et l., 2010) также инфицирующим A. bmnnii: гомология определена для 53 из 89 предполагаемых генов. Кроме того, по одному из предсказанных протеинов 22 обладают гомологией с белками бактериофагов 52 (ORF032), mn E1 и Bkdi BcepB (gp3).

Геном бактериофага 22 имеет модульную организацию и включает гены, кодирующие структурные протеины (белок капсида, белки хвостового отростка, базальной пластинки, хвостовых фибрилл и выростов), ферменты, ответственные за лизис бактериальной клетки-хозяина (фаговый лизоцим – эндолизин и потенциальный холин) и компоненты системы репликации ДНК и нуклеотидного обмена (рис.2).

Следует подчеркнуть, что в геноме фага 22 не идентифицировано ни одного гена, кодирующего токсины или какие-либо известные факторы вирулентности. Кроме того, не выявлены гены, определяющие умеренный (лизогенный) путь развития бактериофага.

Рис. 2 – Геномная карта бактериофага AP22 с указанием функций предсказанных белковых продуктов в геноме фага Таким образом, на основании данных микробиологического, геномного и биоинформационного анализов бактериофаг 22 можно рассматривать в качестве потенциального компонента препарата для лечения инфекций, вызванных A. bmnnii, и использовать для иденБиология фагов тификации бактерий данного вида при бактериологическом анализе клинического материала.

1. Попова, А. В. Молекулярно-генетическая характеристика антибиотико-устойчивых штаммов Ainb bmnnii и оценка их чувствительности к бактериофагу AP22 / А. В.

Попова, В. П. Мякинина, М. Е. Платонов, Н. В. Воложанцев // Мол. генетика, микpобиол., виpусол. – 2012. – № 4. – С. 18-22.

2. Durovin, E. V. tomic force microscopy nlysis of the Ainb b-mnnii cteriophge 22 lytic cycle / E. V. Durovin,. V. opov,. V. Krevskiy, . G. Igntov, T. E.

Igntyuk, I. V. Yminsky,. V. Volozhntsev // Lo OE. – 2012. – Vol. 7. – 10. – e47348.

3. eleg,. Y. Ainb bmnnii: emergence of successful pthogen /. Y. eleg,. eifert, D. L. terson // lin. Microiol. Rev. – 2008. – Vol. 21. – 3. –. 538-582.

4. opov,. V. Isoltion nd chrcteriztion of wide host rnge lytic cteri-ophge infecting Ainb bmnnii /. V. opov, E. L. hilenkov, V.. Mykinin, V. M. Krsilnikov,. V. Volozhntsev // FEM Microiol. Lett. – 2012. – Vol. 332. – 1. –. 40-4.

5. Towner, K. J. Ainb: n old friend, ut new enemy / K. J. Towner // J. osp.

Infect. – 2009. – Vol. 73. – 4. –. 355-33.

. Yng,. Isoltion nd chrcteriztion of virulent cteriophge B1 of Ainb bmnnii /. Yng, L. Ling,. Lin,. Ji // BM Microiology. – 2010. – Vol. 10. –. 131.

MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR GENETIC ANALYSES

OF PHAGE AP22 SPECIFICALLY INFECTING A WIDE RANGE OF

ACINETOBACTER BAUMANNII STRAINS

Popova A.V., Myakinina V.P., Bogun A.G., Volozhantsev N.V.

Key words: big, Ainb bmnnii, gnmi ni.

AP22 ifi infing nd ing wid m f Ainb bmnnii ini in.

УДК

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАГА VB_EVOP_G7C

И РОДСТВЕННЫХ ЕМУ КОЛИФАГОВ С КЛЕТКАМИ ESCHERICHIA

COLI НА РАННИХ СТАДИЯХ ИНФЕКЦИИ

Прохоров Н.С., Куликов Е.Е., Голомидова А.К., Летаров А.В.

ФГБУН «Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН»

тел. +7 (499) 135 72 64; prokhoroff@gmail.com Ключевые слова: N4-подобные бактериофаги, колифаги, взаимодействие вирусов с клеткой, механизмы адсорбции бактериофагов, vB_EP_G7C Работа посвящена анализу механизмов взаимодействия индигенных N4-подобных колифагов, прежде всего vB_EP_G7C, выделенных из симбиотического сообщества лошадей, Биология фагов с клетками E. i на ранних стадиях инфекции. Было показано, что в этой группе реализуется нетипичный для Pdviid механизм узнавания бактериальных клеток, при котором короткие хвостовые фибриллы фага, представленные продуктами двух разных генов, играют роль детерминант не только первичного, но и вторичного необратимого взаимодействия с бактериальными клетками.

Бактериофаги – самые распространенные органические самовоспроизводящиеся объекты на Земле. Оценки их численности в биосфере колеблются от 1030 до 1032 вирусных частиц, составляющих по крайней мере 108 отдельных видов. Легкость их изоляции и культивации в лабораторных условиях, сравнительно небольшие размеры геномов сделали их излюбленными объектами исследований генетиков и молекулярных биологов еще в первой половине XX века. Однако к настоящему времени фокус исследований бактериофагов сместился от регуляции выражения генов и механизмов репликации вирусных геномов к поиску закономерностей взаимодействия вирусов с бактериальными клетками. Можно назвать две большие причины этой тенденции. С самого момента открытия бактериофаги рассматривались как многообещающие кандидаты для терапии бактериальных инфекции. Последующее открытие антибиотиков и развитие соответствующей индустрии, казалось, сняло этот вопрос с повестки дня. Однако темпы возникновения штаммов патогенных микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью заставляют вновь всерьез рассматривать возможность терапевтического применения бактериофагов. С другой стороны, бактериофаги представляют заметную угрозу для любого биотехнологического процесса, оперирующего большой биомассой прокариотических клеток, вызывая тотальный лизис бактерий в биотехнологических производствах. Обе проблемы самым непосредственным образом связаны с феноменом видовой и штаммовой специфичности бактериофагов, определяющей спектр инфицируемых микроорганизмов, и феноменом возникновения резистентных к инфекции форм бактерий.

Результаты и обсуждения В нашей лаборатории наряду с прочими микроорганизмами был изолирован ряд фагов, отнесенный к немногочисленному роду 4-подобных вирусов на основании наличия геномных последовательностей, гомологичных ряду последовательностей генома фага 4, в частности, уникальному среди бактериофагов гену вирионной ДНК-зависимой РНК-полимеразы [1]. Принадлежность изолятов к семейству odoviride дополнительно была показана с помощью электронной микроскопии. Один из этих фагов G7 был подвергнут полному геномному секвенированию (GenBnk: Q259105.1), геномы остальных фагов были секвенированы частично. Анализ полученных последовательностей подтвердил близкое родство выделенных фагов и 4 [2]. Так геном G7 воспроизводит характерные для рода консервативные аппараты репликации и транскрипции. В то же время модуль, по всей вероятности ответственный за взаимодействие вируса с бактериальными клетками, имеет довольно необычное для представителей odoviride устройство – две находящиеся в единой транскрипционной единице ОРС, аннотированные как ОРС и ОРС3.1, кодируют последовательности частично гомологичные мономерам белков хвостовых фибрилл бактериофагов Det7, Vi01 и phioM-G3 из семейства Myoviride. Область гомологии ограничена -концевыми доменами белков. Это весьма необычно, так как принято считать, что -концевые домены хвостовых фибрилл отвечают за прикрепление этих структур к вирусной частице, и должны быть консервативны в рамках семейства ввиду принципиальных отличий в структуре хвостов представителей odoviride и фагов с длинными хвостами. С-концевые и центральные домены предполагаемых белковых продуктов не имеют гомологов в белковых базах данных. Однако продукты обеих ОРС содерБиология фагов жат предсказанные разные по структуре и специфичности гидролитические домены.

Масс-спектрометрический анализ очищенных фаговых частиц подтвердил присутствие обоих белков в структуре вириона. Рекомбинантные белки gp и gp3.1, экспрессированные в E. coli, образуют растворимые гомотримеры, устойчивые к действию денатурирующих агентов. Это свидетельствует в пользу предположения, что они представляют собой мономеры хвостовых фибрилл. Очищенный рекомбинантный белок gp3.1 специфически связывается с клетками штамма, чувствительного к G7, но не связывается с клетками близких штаммов E. coli, устойчивых к инфекции этим фагом. Избыток экзогенного рекомбинантного gp3.1 в жидкой культуре чувствительного штамма полностью блокирует адсорбцию бактериофага на бактериальных клетках. В совокупности полученные данные позволяют предполагать, что продукт гена O3.1 связывается с клеточным рецептором, инициируя адсорбцию вирусной частицы.

Получить рекомбинантный gp, пригодный для металлоафинной хроматографии per se, нам не удалось. Добавление олигогистидиновых последовательностей на - и С-конец полипептида приводило к потери способности gp к тримеризации, что однозначно свидетельствовало о потере белком нативной конформации. Однако, эксперимент по проверке способности белков gp3.1 и gp к взаимодействию друг с другом увенчался успехом. При последовательном нанесении на металлоафинную колонку лизатов, содержащих gp3.1 с олигогистидиновой модификацией и интактный gp, в элюате мы получили очищенный комплекс хвостовых фибрилл. Оценка молекуляной массы полученного комплекса методом гель-фильтрации показала, что в состав комплекса входит по одному тримеру gp3.1 и gp.

Эксперимент по инкубации очищенного комплекса фибрилл gp3.1 и gp с бактериальными клетками разных штаммов показал специфический характер связывания комплекса. Комплекс связывался только со штаммом, чувствительным к инфекции фагом G7. Кроме того, комплекс фибрилл gp3.1 и gp, в отличие от очищенного рекомбинантного gp3.1, связывался с клетками необратимо. Следует отметить, что gp в отсутствии gp3.1 с клетками чувствительного штамма не взаимодействовал. Все это позволяет заключить, что gp3. представляет собой детерминанту первичного обратимого связывания бактериальных клеток, а gp отвечает за необратимую фазу взаимодействия. Кроме того, судя по тому, что комплекс успешно проходит первичные фазы взаимодействия и закрепляется на поверхности клетки, можно уверенно предполагать, что адсорбционный аппарат G7 и родственных ему фагов целиком представлен продуктами генов ОРС и ОРС3.1.

Интересно, что фаг G7 отличается не только примечательно узким спектром хозяев.

но и высокой частотой возникновения устойчивых к нему клонов. Приблизительно 0.01% потомства любого случайного клона выращенного в жидкой культуре в отсутствие G7 выживает на агаре с высокой концентрацией бактериофага. Характер резистентности проверенных нами клонов был адсорбционный. Фаг G7 оказывался не способен даже обратимо взаимодействовать с такими клетками. Анализ клеточных стенок канонического чувствительного штамма и резистентных субклонов показал существенные отличия структуры липополисахаридов внешней мембраны. Примечательно, что один из выделенных нами 4-подобных бактериофагов lt3, наиболее существенное отличие которого от G7 по результатам частичного секвенирования состоит в отсутствии гена ОРС3.1 и нахождение в этом локусе фагового генома принципиально иной рамки считывания, оказывается способным преодолеть адаптации клонов, устойчивых к G7. Так как фаги были изолированы из одной пробы, приведенные факты подтверждают предположение о наличие в природных популяциях с высокой плотностью микроорганизмов динамичных и сложных взаимодействий между коэволюционирующими штаммами бактерий и инфицирующими их бактериофагами.

Биология фагов В нашей работе мы планируем провести дальнейшее исследование структуры и механизмов функционирования адсорбционного аппарата этих необычных вирусов, что, весьма вероятно, приблизит нас к пониманию закономерностей взаимодействий бактериофагов и бактерий и механизмов возникновения форм бактерий, устойчивых к фаговой инфекции.

1. Golomidov, Kulikov E, Isev, Mnykin, Letrov. The diversity of coliphges nd coliforms in horse feces revels complex pttern of ecologicl interctions // ppl Environ Microiol. 2007. T. 73. №19. –. 5975-81.

2. Kulikov E, Kropinski M, Golomidov, Lingohr E, Govorun V, ererykov M, rokhorov, Letrov M, Mnykin, trotsky, Letrov. Isoltion nd chrcteriztion of novel indigenous intestinl 4-relted coliphge vB_Eco_G7 // Virology. 2012. T. 42. №2. –.

93-9.

MECHANISMS OF INTERACTIONS OF VB_ECOP_G7C

BACTERIOPHAGE AND ITS RELATIVES WITH ESCHERICHIA COLI

AT EARLY STAGES OF INFECTION

Prokhorov N.S., Kulikov E.E., Golomidova A.K., Letarov A.V.

Key words: N4-d, ig, vi- inin, mnim f g din, vB_EP_G7C inin N4-d big, vB_EP_G7C m, nd E. i g f g infin. I w idd g f g iiz v n mng dvi mnim f gniin in wi w f i fib v qni im nd nd gniin in ning ivib binding f vi i bi mmbn.

УДК 619:

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙТВА БАКТЕРИОФАГОВ CITROBACTER

Пульчеровская Л.П., кандидат биологических наук, доцент, pulcherovskaya.lidia@yandex.ru Ефрейторова Е.О.,аспирант Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор, Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпиа»

432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Ключевые слова: бактериофаги, негативные колонии, литическая активность, специфичность бактериофагов, бактерии рода Cib.

Изученные фаги бактерий рода Cib имели колонии четырех типов, характеризовались различным спектром литической активности и явились специфичными по отноБиология фагов шению к бактериям рода Cib и не активны к представителям бактерий других родов и семейств.

Особое место в этиологии массовых заболеваний новорожденных животных занимает условно-патогенная микрофлора, которая в отличие от возбудителей «классических» инфекций (н-р: листериоза, лептоспироза и др.) ежедневно поступает с экскрементами клинически здорового маточного поголовья (животных-бактерионосителей). К данной группе и относятся бактерии рода Cib.

Согласно литературным данным бактерии рода Cib выделяются из фекалий больных диареей сельскохозяйственных животных [5,], являются причиной гибели диких животных[7], Основой идентификации цитробактеров является изучение ферментативных свойств и антигенной структуры. Бактериальная диагностика длительна и трудоемка. В связи с этим возникла необходимость в поиске альтернативных методов лабораторной диагностики менее трудоемких, более быстрых и доступных. Одним из таких методов является фагодиагностика [1,2,3,4,9]. Для индикации и идентификации микроорганизмов с помощью бактериофагов необходимо иметь набор фагов с определенными биологическими свойствами.

Мы выделили бактериофаги из объектов окружающей среды Ульяновской и Самарской областей. Перед нами стояла задача – изучить основные свойства выделенных бактериофагов.

Материалы и методы. Материалом для исследований послужили 13 штаммов бактерий рода Cib и 23 бактериофага бактерий рода Cib. Чистые линии фагов получали по методике описанной И.М. Габриловичем (1992), С.Н.Золотухиным (1999).

При изучении свойств выделенных бактериофагов были использованы методы: определение морфологии, спектра литической активности и специфичности выделенных фагов описанными М.Адамс (191); В.Я.Ганюшкин (1988), С.Н.Золотухиным (1999).

Результаты проведенных исследований. В результате проведенных исследований была изучена морфология 23 термостабильных расс фагов, обладающих способностью на индикаторных культурах цитробактера образовывать негативные колонии различных типов. Результаты представлены в таблице 1.

Из таблицы видно, что образовавшиеся колонии можно разделить на четыре типа: 1-й – мелкие полупрозрачные с ровными краями до1 мм в диаметре; 2-й – прозрачные негативные колонии до 2-3мм; 3-й – прозрачные негативные колонии 2-3 мм с зоной неполного лизиса по периферии и 4-й – стерильные пятна 5,0-10,0 мм с зоной неполного лизиса по периферии, ширина зоны 0,5-1 мм.

Биология фагов Таблица 1 - Морфология негативных колоний выделенных бактериофагов 9. Прозрачные округлые негативные колонии с ровными краями, 0,5Прозрачные негативные колонии с ровными краями, 2,0-3,0 и Для получения чистой линии фага проводили от 5 до 7 пассажей из изолированных негативных колоний.

Выделенные бактерифаги обладали разной литической активностью. Литическая активность бактериофагов оценивается по способности фага вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражается это тем максимальным разведением, в котором исследуемый бактериофаг проявлял свое литическое действие. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 -Литическая активность и место выделения фагов бактерий рода Cib выделения Самарская Ульяновская Ульяновская Спектр литической активности является также характерной особенностью штаммов фага и его используют для их идентификации [8].

Для изучения спектра литической активности 23 штаммов выделенных и селекционированных бактериофагов использовали 13 штаммов бактерий рода Cib. Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры. Опыты показали, что изученные фаги характеризуются различным спектром литической активности. Результаты представлены в таблице 3.

Видовая специфичность фагов используется широко в практике для дифференциации бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, сродством их к рецепторам лизируемых бактерий.

Определение видовой специфичности бактериофагов проводили на агаровых средах путем нанесения фага на газон культуры.

Изучение специфичности цитробактерных бактериофагов проводили по отношению к представителям других семейств и родов с использованием штаммов: E.i - 4 штаммов, P.- штаммов, Mgn.- штаммов, Kbi.- 4 штамма, mn.штаммов, Enb.- 4 штамма, Y.nii - 12 штаммов,.- штамма,.-2 штамма, Pdmn gini - 4 штамма, Bi - штамма.

Биология фагов Таблица 3 - Спектр литической активности цитробактерных фагов по отношению к штаммам бактерий Cib № фага испытанных чувствительных В результате изучения специфичности цитробактерных бактериофагов по отношению к представителям других семейств и родов установлено, что данные фаги не лизировали ни одну из испытуемых культур. На основании полученных результатов можно сделать вывод, о том, что выделенные фаги являются специфичными по отношению к бактериям рода Cibи не активны к представителям бактерий других родов и семейств.

1. Адамс М. Бактериофаги. – Москва, 191. – с. 15-44.

2. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. // -М.: Медгиз. –191. –297С.

3.Ганюшкин В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии. Учебное пособие. – Ульяновск, 1988. – с. 45-49.

4. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Бактерии рода Cib и их бактериофаги // Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы. Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2000. - С. 53-58.

5. Пульчеровская Л.П., Золотухин С.Н., Васильев Д.А. Выделение и селекция бактериофагов рода Cib. //Вестник ветеринарии., Выпуск V., Оренбург, - 2002. - С. 85-88.

. Воронин Е.С., Дервишов Д.А. и др. Этиология и профилактика желудочно-кишечБиология фагов ных заболеваний телят // Вестник сельскохозяйственной науки. – 1989. - №9. – С.105-110.

7.Мищенко В.А. и др. Некоторые аспекты патогенеза диареи новорожденных телят // Ветеринария. - 1999. - №9. – С. 20-23.

8. Золотухин С.Н., Пульчеровская Л.П., Кирьянова Н.А., Васильев Д.А. Выделение фагов бактерий рода Cib из объектов внешней среды и патологического материала //«Вестник УГСХА», Сборник научных трудов, Ульяновск, - 2002. - С. 29-32.

9. Золотухин С.Н. Бактериофаги M.morgnii и их применение при желудочно-кишечных заболеваниях поросят //

Автореферат дис. канд. вет. наук. - Ульяновск, 1994.

10. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetell ronchiseptic, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев [и др.] // Вестник УГСХА. – 2011. - №1(13) – С. 59-

BIOLOGICAL PROPERTIES OF BACTERIOPHAGES CITROBACTER

Pulcherovskaya L.P., Еfreytorova Е.О., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.

Кey words: big, ngiv n, i ivi, ifii f big, bi f gn Cib.

nn-iv niv f bi f gn nd fmii.

УДК 619:

ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ

БАКТЕРИЙ РОДА CITROBACTER

Пульчеровская Л.П., кандидат биологических наук, доцент, pulcherovskaya.lidia@yandex.ru Ефрейторова Е.О.,аспирант Золотухин С. Н., доктор биологических наук, профессор, Васильев Д. А., доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпиа»

432017, г.Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1.

Ключевые слова: Бактериофаги, электронная микроскопия, вирион, бактерии рода Cib, морфология фагов.

В соответствии с морфологическими параметрами изучаемые нами фаги бактерий рода Cib №1, №2 и №3 согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Mviid, а по классификации А.С. Тихоненко - к V морфологической группе: “аги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению” Бактериофаги представляют собой наиболее многочисленную, широко распростраБиология фагов ненную в биосфере и, предположительно, наиболее эволюционно древнюю группу вирусов. В природных условиях фаги встречаются в тех местах, где есть чувствительные к ним бактерии.

Предположение, что бактериофаги имеют корпускулярную природу, было высказано еще д’Эреллем на основании их способности образовывать на бактериальных газонах собственные негативные колонии ограниченных размеров. Позже это предположение было подтверждено при исследовании очищенных фагофильтратов в темном поле микроскопа, при их ультрацентрифугировании и ультрафильтрации через специально градуированные коллодийные фильтры. Но только изобретение электронного микроскопа позволило увидеть фаги. Так, уже в начале 40-х годов X. Руска (Н. Rusk) показал, что в фаголизатах дизентерийных бактерий, кишечной палочки, протея, стафилококков и стрептококков содержатся особые тельца, состоящие из головки и более или менее длинного хвоста. [4,7] Дальнейшее усовершенствование электронного микроскопа с постоянным повышением его разрешающей способности дало возможность многим исследователям более точно уяснить общую морфологию различных фагов, изучить отдельные детали их структуры и процессы размножение в бактериальной клетке. Особенно ценным в этом отношении явилось применение методов так называемого негативного контрастирования препаратов с помощью растворов фосфорно-вольфрамовой кислоты, урацил-ацетата и некоторых других веществ, а также получение ультратонких срезов зараженных фагами бактериальных клеток. Очень полезным для изучения фагов в процессе их взаимодействия с бактериями явилось применение сканирующего электронного микроскопа, дающего особо рельефные изображения.

С помощью электронного микроскопа установлено, что фаг состоит из головки и отростка (хвоста). Размеры фагов колеблются от 20 до 200 им. Отросток состоит из внутреннего стержня и наружного сокращающегося футляра. На дистальном конце отростка расположена базальная пластинка с зубцами, от которых отходят длинные нити. Базальная пластинка и нити осуществляют процесс адсорбции частицы фага на бактериальной клетке. [4] Материалом для электронно-микроскопических исследований использовали лизаты бульонных культур C. fndii № 9, C. fndii № 1 и C. mni № 11 с бактериофагами №1, №2, №3 в титре от 3 х 109 до 4 х 109 фаговых корпускул в 1 мл (по Грациа), выделенные нами бактериофаги бактерий рода Cib из сточных вод Ульяновской и Самарской областей.

Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили осаждением вирусных частиц в режиме низкоскоростного центрифугирования. В процессе центрифугирования вируссодержащей суспензии происходит образование новой фазы - осадка из белковых макромолекул. Захват осадком вирусных частиц, которые сами по себе в данных условиях осадков не образуют, характеризуется как метод концентрирования за счет соосаждения.

С этой целью суспензии фага в объёме 1 мл предварительно осветляли на центрифуге при 500 g в течение 10 мин. Затем надосадочную водную фазу повторно центрифугировали при 2000 g в течение 30 мин. Из пробирки полностью сливали жидкость, а образовавшийся осадок ресуспендировали в 30-50 мкл буферного раствора рН 7,3-7,5. Вирусные частицы, соосаждаясь с белковыми макромолекулами, в данном режиме центрифугирования образуют концентрированную суспензию в 10-20 раз. Данная методика отработана для работы с вирусами животных и успешно применяется при подготовке препаратов для электронной микроскопии (Пономарев, Андреева, Артамонова, 2002).

Вирусные препараты наносили на поддерживающие угольно-парлодионовые пленкиподложки для электронно-микроскопических исследований. Контрастирование вирионов проводили с использованием 4% раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты рН,8. ИсследоваБиология фагов ния проводили на электронном микроскопе JЕМ-100В (Япония). Размеры вирионов определяли на измерительном микроскопе МИР-12т непосредственно с негативных фотопластинок. В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага имеют структуры, состоящие из головки в форме растянутого многогранника с отростком. У основной массы вирионов чехол находится в растянутом состоянии, что характерно для интактных частиц. Чехол отростка на всем протяжении прямой и имеет цилиндрическую форму.

Единичные вирионы имеют отросток в сокращенном состоянии, то есть чехол отростка укорачивается и расширяется. При этом просматривается внутренний стержень отростка.

Вирусные частицы фагов №2 и №3 имеют следующие размеры: диаметр головки: 100 нм и длина отростка – 135 нм. Отношение высоты головки к её диаметру у фагов равно 1,28, что позволяет заключить о растянутости многогранника частиц данных фагов. Корпускулы фага №1 имеют более симметричную головку, её длина равна 74 нм, диаметр 8 нм. Отношение высоты головки к её диаметру равно 1,08. Длина отростка 115 нм и длина сокращённого чехла отростка 0 нм.

Вирусные частицы выделенных нами бактериофагов имеют форму аналогичную фагам, изученным Т.А. Хакешевой с соавт. (1985).

Таким образом, в соответствии с морфологическими параметрами изучаемые нами фаги №1, №2 и №3 согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Mviid [8], а по классификации А.С. Тихоненко - к V морфологической группе: “Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению” [5]. К названной группе относятся ДНК-содержащие фаги булавовидной формы, но имеющие мощный отросток сложного строения. Он состоит из наружного сокращающегося чехла, внутреннего жесткого полого стержня и хорошо выраженной базальной пластинки. Последняя в свою очередь имеет ряд элементов типа выростов с шипами или зубьями на концах и почти у всех фагов снабжена длинными нитями. При сокращении чехол отростка расширяется и укорачивается, обнажая дистальный конец внутреннего стержня, который может проникать через клеточную стенку бактерий. У некоторых фагов пятой группы, кроме перечисленных элементов, обнаружены дополнительные структуры в виде воротничка или муфты в месте прикрепления отростка к головке и т. п. [1,2,3,] Морфология исследуемых фагов представлена на рисунках 1, 2 и 3.

Рис. 1 - Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-52 УГСХА х Биология фагов Рис. 2 - Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-61 УГСХА х Рис. 3 - Электронная микрофотография. Морфология бактериофага С-66 УГСХА х 1. Ляшенко Е. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Kbi, конструирование на их основе биопрепарата // Автореферат дис. канд. вет. наук. Саратов, 200.

2. Молофеева Н.И. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов Eii i О157 и их применение в диагностике // Автореферат дис. канд. биол.

наук. - Саратов, 2004.

3. Пульчеровская Л.П.. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов itrocter и их применение в диагностике // Автореферат дис. канд. вет. наук. Саратов, 2004.

4. Ревенко И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике // – Киев:

Урожай, - 1978. – С. 88.

5. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий //М.: Наука, 198. – С. 89.

. Феоктистова Н.А. Выделение и изучение биологических свойств фагов бактерий рода roteus, конструирование на их основе биопрепарата и разработка параметров его практического применения // Автореферат дис. канд. вет. наук. - Саратов, 200.

7. Хакешева Т.А. Фаги цитробактера // Автореферат канд. дис. – М. – 1985.

8. Murphy F.. Virus Txonomy. lssifiction nd omenclture of Viruses // pingerverld Wien ew York. – 1995. –. 58.

ELECTRON MICROSCOPY OF ALLOCATED BACTERIOPHAGES OF

BACTERIA OF THE GENUS CITROBACTER

Pulcherovskaya L.P., Еfreytorova Е.О., Zolotukhin S.N., Vasilev D.А.

n Cib №1, №2 nd №3 ding Innin ifiin nd nmn f УДК 578: 615.

ВЫДЕЛЕНИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

И ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ БАКТЕРИОФАГА ЕСD

ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

ESCHERICHIA COLI О104:H4-ИНФЕКЦИИ.

Светоч Э.А.*, доктор ветеринарных наук, профессор, тел. (4967)-36-00-79; svetoch@obolensk.org Веревкин В.В.*, кандидат медицинских наук, Воложанцев Н.В.*, кандидат биологических наук, тел. (4967)-36-01-47; nikvol@obolensk.org Борзилов А.И.*, кандидат медицинских наук, тел. (4967) 36 01 47, borzilov@obolensk.org Борзенков В.Н.*, кандидат медицинских наук, Коробова О.В.*, кандидат медицинских наук, Красильникова В.М.*, кандидат биологических наук, Мякинина В.П.*, Теймуразов М.Г.*, кандидат биологических наук, Коровкин С.А.**, доктор медицинских наук, профессор, тел.(495) 917-41-49, korovkin09@mail.ru Биология фагов Дятлов И.А.*, чл.-корр РАМН, доктор медицинских наук, профессор, тел. (4967) 36 00 03, dyatlov@obolensk.org *ФБУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии»

**НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН Ключевые слова: Eii i, шига-токсин, бактериофаг, мыши Bb/, литическая активность фагов.

Изучены свойства бактериофага ЕСD4, активного против эпидемического шигатоксин продуцирующего штамма E.соi серотипа O104:H4, некоторых ЕЕС-штаммов сесоi ротипа О157:7 и других клинически значимых эшерихий и шигелл. Установлено, что бактериофаг персистирует определенное время в организме интактных мышей линии Bb/ и в 6-8 раз снижает концентрацию E. соi O104:H4 в кишечнике инфицированных мышей. Обсуждаются пути повышения лечебной эффективности фагов при экспериментальной E.соi O104:H4-инфекции.

Шига-токсин продуцирующие Eii i (TE) вызывают у человека потенциTE) ) ально летальные заболевания с широким спектром клинических проявлений: от банальной легкой формы диареи до тяжелого геморрагического колита (ГК), осложненного гемолитикоуремическим синдромом (ГУС) и тромботической тромбоцитопенической пурпурой [1 - 3].

Основными возбудителями TE-инфекций является группа энтерогеморрагических E.i (ЕНЕС), принадлежащих к серотипу О157:Н7 (ведущий патоген) и к серогруппам 02, 055, 091, 0103, 0111, 0113, 0121, 0145, реже другим. 21 мая 2011 года в Германии появились сообщения об эпидемической вспышке заболевания, вызванного шига-токсин продуцирующим штаммом E.соi серотипа O104:4 [4]. В течение последующих двух месяцев в странах Европейского Союза (преимущественно в Германии), а также в США, Канаде и Швейцарии было зарегистрировано более 4000 случаев заболевания, связанного с этим возбудителем, причем в 773 случаях болезнь сопровождалась симптомами гемолитико-уремического синдрома. За время TE-эпидемии погибло 54 человека [5].

Причиной описанной TE-вспышки во всех странах явился новый уникальный штамм E.соi O104:H4, сочетающий в себе факторы вирулентности энтероаггрегативных (EggE) и энтерогеморрагических (ЕНЕС) эшерихий. Кроме того, эпидемический штамм E.соi O104:H4 был устойчив к большой группе антибиотиков: ампициллину, амоксициллину/ клавуланату, пиперациллину/сульбактаму, пиперациллину/тазобактаму, цефураксиму, цефураксим-аксетилу, цефокситину, цефотаксиму, цефразидиму, цефподоксиму, стрептомицину, налидиксовой кислоте, татрациклину, триметоприму/сульфаметаксозолу. Штамм E.соi O104:H является носителем плазмидных генов l TX-M-15 и l TEM-1.

Высокий процент случаев ГУС, отмеченный при вспышке E.i О104:4-инфекции в Германии (22 %), а также высокая смертность среди больных с ГУС (свыше 4 %) свидетельствуют о серьезных проблемах в лечении этой инфекции, связанных с низкой эффективностью антибиотикотерапии. Более того, применение антибиотиков может усугублять течение болезни [].

В данной ситуации остро встает вопрос о поисках альтернативных методов профилактики и антимикробной терапии E.i О104:4-инфекции. Вполне оправдано, что одним из таких подходов может стать использование специфических бактериофагов [5, 7].

Цель работы – поиск и характеристика литических бактериофагов, активных против эпидемического штамма E.i О104:4, изучение их профилактической и лечебной эффективности на экспериментальной мышиной модели E.i О104:4-инфекции.

Материалы и методы исследования Для выделения бактериофагов и характеристики их литической активности использовали индикаторные штаммы эшерихий различных серогрупп, а также штаммы Eii i К12 С00, E. i М17, ig nni, ig flxni и ig dni. Штамм Eii i О104:12 513 (далее E.i О104:12), не продуцирующий шига-токсинов, получен из института им. Л.И. Тарасевича (г. Москва). Штамм E.i О104:4 №112027 tx (далее E.i О104:4) выделен от больного ГК при пищевой вспышке в 2011 г. в Германии и любезно предоставлен д-ром Альфредо Каприоли (Европейская референс-лаборатория E.i, Институт санитарии, г. Рим, Италия). Штамм продуцирует шига-токсин типа 2 и устойчив к бета-лактамным антибиотикам, стрептомицину, налидиксовой кислоте, тетрациклину, триметоприму/сульфаметоксазолу.

Бактериальные культуры выращивали при 37°С в течение 18-24 ч на плотной и жидкой питательных средах ГРМ (ФБУН ГНЦ ПМБ).

Вирулентные фаги, активные против E.i О104:4, выделяли из образцов подстилки и фекалий бройлерной птицы на птицефабриках Московской и Калужской областей. Бактериофаги идентифицировали с помощью спот-теста и последующего титрования на чувствительных штаммах E.i К12 С00, E. i О104:12 и E.i О104:4. «Чистые» линии фагов получали из изолированной негативной колонии после трех последовательных пересевов на газоне чувствительного штамма. Специфичность и спектр антибактериального действия фагов определяли методом спот-тестирования и стандартным двухслойным методом с использованием индикаторных штаммов.

Фаговую ДНК выделяли из обработанного протеиназой К фаголизата на колонках фирмы QIGE (QI-mp D Midi Kit).

Фармакокинетику – продолжительность персистирования бактериофага ЕСD4 изуча-D ли на мышах линии Bl/c массой 17-20 г. В эксперимент было взято 4 группы животных (по особей каждая). Мышам первых двух групп натощак внутрижелудочно вводили фаг по 0, мл с концентрацией 1107 и 1109 БОЕ/мл, соответственно, мыши третьей группы получали бактериофаг с питьевой водой. Через 1,5; 3,, 9, 12, 24, 3 и 48 ч после введения фага от каждой мыши отбирали фекалии (по 0,1 г), помещали их в пробирку с 1 мл M буфера и мкл хлороформа. Компоненты интенсивно встряхивали 20 мин, взвесь центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин и из полученного центрифугата готовили десятикратные разведения.

Количество фаговых частиц в образцах определяли нанесением 10 мкл каждого разведения на газоны E.i К12 С00 с последующим подсчетом негативных колоний фага ЕСD4.

Четвертую группу мышей через 1, 3, 9 и 12 часов (по три мыши на каждый срок) после внутригастрального введения фага ЕСD4 (~ 2109 БОЕ) умерщвляли с помощью СО2, и в крови, селезенке и печени каждой особи определяли наличие фаговых частиц.

Профилактическую и лечебную эффективность фага ЕСD4 оценивали на эксперименD тальной мышиной модели (мыши линии Bl/c) E.i О104:4-инфекции, которая обеспечивала стабильную колонизацию кишечника животных в концентрации не менее чем 1108 КОЕ патогена на 1 г содержимого. В эксперименте использовали 24 мыши, которые были разделены на 3 группы: опытную и две контрольные. Животные всех трех групп, начиная с первого дня и на протяжении всего эксперимента, получали с питьевой водой стрептомицин (5 г/л) для подавления других, кроме E.i О104:4, представителей рода Eii. Начиная со второго дня и в течение всего срока эксперимента (7 дней) мыши опытной группы получали бактериофаг ЕСD4 с питьевой водой (~ 2108 БОЕ/мл). Мыши первой контрольной группы бактериофаг не Биология фагов получали (контроль колонизации кишечника штаммом E.i О104:4). На третий день эксперимента животные опытной и первой контрольной групп интрагастрально заражали штаммом E.i О104:4 в дозе 1109 КОЕ/особь. Третья контрольная группа мышей оставалась не зараженной, но получала бактериофаг по той же схеме, что и опытная группа. На 1, 2, 3, и сутки после заражения у мышей всех экспериментальных групп, опытной и двух контрольных, отбирали образцы фекалий и определяли в них концентрацию бактериофага ЕСD4 и клеток E.i О104:4. В последнем случае высев фекалий и подсчет колоний патогена проводили на питательном агаре и среде Эндо со стрептомицином (50 мкг/мл). Принадлежность выросших культур бактерий к серотипу E.i О104:4 подтверждали в реакции латекс-агглютинации и методом ПЦР в соответствии с Методическими указаниями [8].

Результаты и их обсуждение В результате проведенного поиска из образцов фекалий и подстилки бройлерной птицы удалось выделить семь «чистых» линий бактериофагов, обладающих литической активностью против шига-токсин продуцирующего эпидемического штамма E.i О104:4 и штамма E.i О104:12. Свойства одного из фагов – фага ЕСD4, как наиболее перспективного, были изучены более подробно.

Батериофаг ЕСD4 способен подавлять рост бактерий штамма E.i О104:4 до восьмого десятикратного разведения при титровании по Аппельману. Кроме того, фаг обладает литической активностью по отношению к некоторым шига-токсин продуцирующим штаммам E.i О157:7, клинически значимым эшерихиям других серогрупп, а также бактериям.nni и.flxni – возбудителям дизентерии человека. Вместе с тем, фаг не подавляет рост бактерий непатогенного для человека штамма E.i М17, используемого для приготовления пробиотического препарата «Колибактерин», но может быть размножен на непатогенном штамме E.i К12 С00, что значительно упрощает крупномасштабную наработку данного бактериофага.

На чувствительном бактериальном штамме бактериофаг ЕСD4 формирует мутные неD гативные колонии диаметром около 1 мм; вторичный рост клеток-хозяина в зоне лизиса отсутствует. Геном фага представлен двухнитевой ДНК размером около 0 тыс. пар оснований.

ДНК не гидролизуется ферментами lG1, stI, EcoRI, Bm1, indIII, pI, KpnI, Eco1471, Eco521, Eco1301, MvI. Эндонуклеаза miI расщепляет ДНК фага ЕСD4 на три фрагмента, два из которых имеют размер 700 и 3000 пар оснований, BcuI расщепляет ДНК на шесть фрагментов, EcoRV - на 15, XmiI - на 18, VspI - на 20 фрагментов. В фаговом геноме не выявлено генов синтеза шига-подобных токсинов и других факторов вирулентности, характерных для бактерии-хозяина.

Как показали наши исследования, фаг ЕСD4 способен определенное время циркулиD ровать в организме мышей, свободном от клеток-хозяина. Продолжительность персистирования этого фага в кишечнике интактных животных после внутригастрального введения вируса в дозе ~ 1107 БОЕ/особь составляла не менее 24 часов. При введении мышам фага в большей дозе (1109 БОЕ) вирусные частицы у отдельных особей выделяли через 3 час. Через 48 часов фаг из фекалий изолировать не удавалось.

При доставке фага ЕСD4 мышам с питьевой водой (2108 БОЕ/мл) вирус обнаруживали в фекалиях через 24 ч. после его введения, в более поздние сроки фаг не выявляли.

При внутригастральном введении мышам фага ЕСD4в дозе ~ 1109 БОЕ/особь вирусные частицы проникали из желудочно-кишечного тракта в кровь и паренхиматозные органы животных и определенное время персистировали в них. В крови и селезенке фаговые частицы у отдельных особей обнаруживали через 12 час, в печени – лишь через час после его введения.

Таким образом, фаг ЕСD4 обладает важным свойством лечебного фага – способноD стью персистировать определенное время в организме животного, длительность которого зависит от дозы фага и способа его доставки в организм.

Результаты эксперимента по изучению профилактической эффективности бактериофага ЕСD4 показали, что предварительное, еще до заражения, выпаивание фага животным в течение суток не предотвращало колонизацию кишечника мышей линии Bl/c штаммом E.i О104:4 (мышей заражали интрагастрально на 3-ий день после начала эксперимента в дозе ~ 1109 КОЕ/особь). Тем не менее, концентрация возбудителя в кишечном содержимом мышей опытной группы, получавших с водой фаг ЕСD4, была в разы ниже, чем у животных контрольной группы, которая бактериофаг не получала: на 1, 2, 3, и 7 сутки после заражения количество E.i О104:4 в расчете на 1 г фекалий было ниже у опытных по сравнению с контрольными животными соответственно в 5,9;,5;,7; 8,4 и 7,8 раз. В те же сроки бактериофаг ЕСD4 обнаруживали в фекалиях опытной (леченой) группы мышей в значительных конценD трациях: от ~ 1107 до 1108 БОЕ/г, т.е. фаг активно репродуцировался в кишечнике зараженных животных. Напротив, у мышей контрольной группы, которая получала фаг с питьевой водой в течение 7 дней, но не заражалась E.i О104:4, концентрация фага была значительно ниже, чем в опытной группе.

Низкая профилактическая лечебная эффективность фага ЕСD4, полученная нами на экспериментальной мышиной модели E.i О104:4-инфекции, на фоне активного размножения его в кишечнике зараженного животного, скорее всего, объясняется образованием клетками штамма E.i О104:4 биопленки, которая, как известно, может существенно влиять на взаимоотношения фага с клеткой-хозяином.

Решение задачи повышения лечебной эффективности фаговых препаратов против E.i О104:4-инфекции, по-видимому, лежит в области поиска специфических фагов, способных разрушать биопленки в кишечнике макроорганизма, либо применение коктейля фагов с такими свойствами.

Изучение фага ЕСD4, способного лизировать шига-токсин продуцирующие эшериD4, хии, другие патогенные E.i и шигеллы будет продолжено. Особое внимание будет уделено вопросам использования его для деконтаминации продуктов питания и объектов внешней среды от опасного для человека патогена E.i О104:4, поскольку именно этот путь представляется на сегодня, когда еще не ясен природный резервуар и источник возбудителя, наиболее реальным и безопасным.

1. prioli,. Enterohemorrhgic Eii i: emerging issues on virulence nd modes of trnsmission /. prioli,. Morito,. Brugre, E. Oswld // Vet. Res. - 2005. – Vol.

3. –. 289-311.

2. Krmli, M.. Infection y verocytotoxin-producing Eii i / M.. Krmli // lin. Microiol. Rev. - 1989. – Vol. 2. –. 15–38.

3. Krmli, M. ssocition of genomic O islnd 122 of Escherichi coli EDL 933 with verocytotoxinproducingEii iseropthotypes tht re linked to epidemic nd/or serious disese / M.. Krmli, M. Mscrenhs,. hen, K. ieell,. Johnson, R. Reid-mith, J. IscRenton,. lrk, K. Rhn, J.B. Kper // J. lin. Microiol. - 2003. – Vol. 41. –. 4930-4940.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/12/10 23 July 2014 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Двенадцатое совещание Пхёнчхан, Республика Корея, 6-17 октября 2014 года Пункт 12 предварительной повестки дня* ОБНОВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРЕСМОТРА/ОБНОВЛЕНИЯ И ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТРАТЕГИЙ И ПЛАНОВ ДЕЙСТВИЙ ПО СОХРАНЕНИЮ БИОРАЗНООБРАЗИЯ, ВКЛЮЧАЯ НАЦИОНАЛЬНЫЕ ЦЕЛЕВЫЕ ЗАДАЧИ, И ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ПЯТЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ ДОКЛАДОВ Записка Исполнительного секретаря**...»

«УСТАВ РУССКОГО ЭНТОМОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА ПРИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (Принят Бюро Отделения общей биологии РАН 27 марта 1995 г.) 1. Общие положения 1.1. Русское энтомологическое общество при Российской академии наук, в дальнейшем именуемое РЭО, является некоммерческой организацией — научным обществом Отделения общей биологии при РАН — и осуществляет свою деятельность в соответствии с существующим законодательством и настоящим Уставом. 1.2. РЭО является юридическим лицом. Оно имеет свои...»

«В.К. Шитиков, Г.С. Розенберг ОЦЕНКА БИОРАЗНООБРАЗИЯ: ПОПЫТКА ФОРМАЛЬНОГО ОБОБЩЕНИЯ 1. Общий подход к оценке биологического разнообразия 1.1. Развитие концепций и определение основных понятий Понятие биологическое разнообразие за сравнительно короткий отрезок времени получило расширенное многоуровневое толкование. Собственно его биологический смысл раскрывается через представления о внутривидовом, видовом и надвидовом (ценотическом) разнообразии жизни. Однако, в добавление к этому, сначала...»

«1-е информационное письмо Федеральное агентство научных организаций Российская академия наук Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений Министерство сельского хозяйства и перерабатывающей промышленности Краснодарского края Министерство образования и науки администрации Краснодарского края ВПРС Международной организации по биологической борьбе с вредными животными и растениями (МОББ) Российская Технологическая Платформа Биоиндустрия и Биоресурсы – БиоТех2030...»

«В защиту наук и Бюллетень № 8 67 Королва Н.Е. Ботаническую науку – под патронаж РПЦ? (по поводу статьи члена-корреспондента РАН, д.б.н. В.К. Жирова Человек и биологическое разнообразие: православный взгляд на проблему взаимоотношений)119 1. Проблема Проблемы взаимодействия власти и религии, науки и религии, образования и религии требуют современного переосмысления и анализа. Возможен ли синтез научного и религиозного знания, и не вредит ли он науке и научной деятельности, и собственно,...»

«Уважаемые участники конференции! От имени Дальневосточного государственного технического рыбохозяйственного университета я рад приветствовать вас на очередной Международной научно-технической конференции Актуальные проблемы освоения биологических ресурсов Мирового океана. Я уверен, что в ходе работы мы сможем обсудить множество актуальных тем: совершенствование существующих технологий, нахождение путей оптимизации эксплуатации биоресурсов, исчезновение некоторых видов рыб, а также многие другие...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/7/18 РАЗНООБРАЗИИ 10 November 2003 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Седьмое совещание Куала-Лумпур, 9-20 и 27 февраля 2004 года Пункт 20.1 предварительной повестки дня* ФИНАНСОВЫЕ РЕСУРСЫ И МЕХАНИЗМ ФИНАНСИРОВАНИЯ (СТАТЬИ 20 И 21) Дополнительные финансовые ресурсы Записка Исполнительного секретаря I. ВВЕДЕНИЕ 1. В преамбуле Конвенции о биологическом разнообразии признается, что...»

«Российская академия наук Институт озероведения РАН Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем II Bioindication in monitoring of freshwater ecosystems II Издательство Любавич Санкт-Петербург 2011 УДК 504.064.36 Ответственные редакторы: Член-корр. РАН В.А. Румянцев, д.б.н. И.С. Трифонова Редакционная коллегия: д.б.н. И.Н. Андроникова, к.б.н. В.П. Беляков, к.б.н. О.А. Павлова, к.б.н. М.А. Рычкова Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем II. Сборник материалов международной...»

«ФГБОУ ВПО Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии Ульяновская МОО Ассоциация практикующих ветеринарных врачей АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Материалы V-й Всероссийской (с международным участием) студенческой научной конференции 25 – 26 апреля 2012 года Ульяновск – 2012 Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии УДК 631 Актуальные проблемы инфекционной...»

«UNEP/CBD/COP/7/21 Страница 112 Приложение РЕШЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ СЕДЬМЫМ СОВЕЩАНИЕМ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Решение Страница VII/1. Биологическое разнообразие лесов 113 VII/2. Биологическое разнообразие засушливых и субгумидных земель 114 VII/3. Биологическое разнообразие сельского хозяйства 124 VII/4. Биологическое разнообразие внутренних водных экосистем 125 VII/5. Морское и прибрежное биологическое разнообразие 159 VII/6. Процессы проведения оценок 216 VII/7....»

«01 – 31 августа 2013 2013 Содержание Общие тенденции инновационной сферы Биотехнологии Медицина и здравоохранение Новые материалы и нанотехнологии Транспортные и космические системы Рациональное природопользование Энергоэффективность и энергосбережение Список источников 2 Общие тенденции инновационной сферы Российские ученые создают искусственное человеческое тело Российские ученые приступили к разработке протеза всего человеческого тела. Об этом в ходе пресс-конференции заявил профессор МГУ,...»

«Труды VI Международной конференции по соколообразным и совам Северной Евразии ОСЕННЯЯ МИГРАЦИЯ СОКОЛООБРАЗНЫХ В РАЙОНЕ КРЕМЕНЧУГСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА М.Н. Гаврилюк1, А.В. Илюха2, Н.Н. Борисенко3 Черкасский национальный университет им. Б. Хмельницкого (Украина) 1 gavrilyuk.m@gmail.com Институт зоологии им. И.И. Шмальгаузена НАН Украины 2 ilyuhaaleksandr@gmail.com Каневский природный заповедник (Украина) 3 mborysenko2905@gmail.com Autumn migration of Falconiformes in the area of Kremenchuh...»

«UNEP/CBD/COP/7/21 Страница 112 Приложение РЕШЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ СЕДЬМЫМ СОВЕЩАНИЕМ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Решение Страница VII/1. Биологическое разнообразие лесов 114 VII/2. Биологическое разнообразие засушливых и субгумидных земель VII/3. Биологическое разнообразие сельского хозяйства 114 VII/4. Биологическое разнообразие внутренних водных экосистем 114 VII/5. Морское и прибрежное биологическое разнообразие 160 VII/6. Процессы проведения оценок 114 VII/7. Оценка...»

«НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ СОВЕТ БОТАНИЧЕСКИХ САДОВ И ДЕНДРОПАРКОВ УКРАИНЫ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЭКОМОНИТОРИНГА И БИОРАЗНООБРАЗИЯ МЕГАПОЛИСА НАЦИОНАЛЬНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ИМ. Н.Н. ГРИШКА Международная научная конференция РОЛЬ БОТАНИЧЕСКИХ САДОВ И ДЕНДРОПАРКОВ В СОХРАНЕНИИ И ОБОГАЩЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ 28-31 мая 2013 года Первое информационное письмо КИЕВ – 2012 ГЛУБОКОУВАЖАЕМЫЕ КОЛЛЕГИ! Приглашаем вас принять участие в работе Международной научной...»

«16.11.2013 (суббота) Регистрация, кофе, плюшки 8:30-9:30 Открытие конференции 9:30-10:30 Проректор по обеспечению реализации образовательных программ и осуществления научной деятельности по направлениям география, геология, геоэкология и почвоведение СПбГУ С.В. Аплонов Декан факультета географии и геоэкологии Н.В. Каледин Зав. кафедры гидрологии суши Г.В. Пряхина ООО НПО Гидротехпроект А.Ю. Виноградов Организационный Комитет Л.С. Лебедева Посвящение Ю.Б. Виноградову 10:30-11:00 Т.А. Виноградова...»

«Камчатский филиал Тихоокеанского института географии (KФ ТИГ) ДВО РАН Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО) Биология Численность Промысел Петропавловск-Камчатский Издательство Камчатпресс 2009 ББК 28.693.32 Б90 УДК 338.24:330.15 В. Ф. Бугаев, А. В. Маслов, В. А. Дубынин. Озерновская нерка (биология, численность, промысел). Петропавловск-Камчатский : Изд-во Камчатпресс, 2009. – 156 с. В достаточно популярной форме представлены научные данные о...»

«Ukraine, Russia, Kazakhstan and Turkmenistan, shows its relationship with the 11-year cycle of solar activity, when it peaks occur during periods of sharp increase or decrease in solar activity near the maximum, and minimum - for periods of low solar activity ( fig.) Among the countries of Eastern and Western Europe is characterized by similar dynamics only for Romania. For other countries the situation is not so clear, it is associated with dominance or high-frequency oscillation periods of...»

«Уважаемые коллеги! Миркин Б.М., д.б.н., профессор, Башкирский Оргкомитет планирует опубликовать научные гос. университет материалы конференции к началу ее работы. Приглашаем Вас принять участие в работе П е н ч у ко в В. М., а к а д е м и к РАСХ Н, Для участия в работе конференции Международной научной конференции необходимо до 1 февраля 2010 года Ставропольский гос. аграрный университет Теоретические и прикладные проблемы П е т р о в а Л. Н., а к а д е м и к РА С Х Н, н ап р а в и т ь...»

«НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ Материалы VI-й Международной студенческой научной конференции, посвящённой 70-летию ФГБОУ ВПО Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина 14 – 15 мая 2013 года Часть I Ульяновск – 2013 Актуальные проблемы инфекционной патологии и биотехнологии НИИЦМиБ ФГБОУ ВПО...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/10/18 23 August 2010 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Десятое совещание Нагоя, Япония, 18-29 октября 2010 года Пункт 4.9 повестки дня ПРИВЛЕЧЕНИЕ К РАБОТЕ СУБЪЕКТОВ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И ОСНОВНЫХ ГРУПП И УЧЕТ ГЕНДЕРНОЙ ПРОБЛЕМАТИКИ Записка Исполнительного секретаря ВВЕДЕНИЕ I. Эффективное осуществление Конвенции зависит от участия и привлечения к работе 1. субъектов деятельности и коренных и местных общин. Об этом...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.