WWW.KONFERENCIYA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Конференции, лекции

 

Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |

«Том I Ульяновск - 2013 Материалы международной научно-практической конференции Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой ...»

-- [ Страница 5 ] --

4. oon, J.M. Eii i O104:4 outrek from sprouted seeds / J.M. oon,. emn, R.. Bines // Int J yg Environ elth – 2012 - ug 13. [Epu hed of print] 5. Merishvili, M, De Vos, D., Vereken, G, et l. election nd chrcteriztion of cndidte therpeutic cteriophge tht lyses the Eii i O104:4 strin from the 2011 outrek in Germny // LO OE.-2012.-Vol.7.- Iss.12. –.e Биология фагов. Michel M, Elliott EJ, Ridley GF, odson EM, rig J. Interventions for hemolytic uremic syndrome nd thromotic thromocytopenic purpur. ochrne Dtse yst Rev. -2009.D003595.

7. Dmien Mur, Eric Morello, Lurence du Merle, errine Bomme, hntl Le Bougunec, Lurent Derieux. Intestinl coloniztion y enteroggregtive Eii i supports longterm cteriophge repliction in mice/ // Environment. Microiol. -2011.– Vol.14.-.1844- 8. Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Eii i, продуцирующих шига-токсины (TE-культуры), и обнаружению возбудитеTE-культуры), лей TE-инфекций в пищевых продуктах// МУК 4.2.293-11// Москва,

BACTERIOPHAGE ECD4: ISOLATION, CHARACTERIZATION

AND ESTIMATION OF THE TREATMENT EFFECT AT EXPERIMENTAL

ESCHERICHIA COLI O104:H4-INFECTION Svetoch E.A., Verevkin V.V., Volozhantsev N.V., Borzilov A.I., Borzenkov V.N., Korobova O.V., Kombarova T.I., Krasilnikova V.M., Myakinina V.P., Bannov V.A., Denisenko E.A., Teimurazov M.G., Korovkin S.A., Dyatlov I.A.

Key words: Eii i, ig-xin, big, Bb/ mi, i ivi O104:H4, m EHEC O157:H7 in nd ini E. i in; nd m ig in w dmind. I w wn g i f m im in bd f nn-infd mi Bb/ nd d n 6-8 im v f gn in infd mi inin. T w f ining f big mn ff ximn E. iO104:H4 infin i did.

УДК 578.

ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИИ ФАГОВ ФИТОПАТОГЕННЫХ

БАКТЕРИЙ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В АГРОЦЕНОЗАХ УКРАИНЫ

Семчук Л. И., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Lidia_Semchuk@univ.kiev.ua Постоенко Е.М., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ОНЦ «Институт биологии» Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, тел. +38-044- 521-35-02.

Ключевые слова: Бактериофаги, экология, фитопатогенные бактерии, нуклеиновые кислоты, рекомбинанты Изучали экологию фагов фитопатогенных бактерий четырнадцати штаммов родов Xnmn, Ewini и Pdmn. аги, в отдельном биоценозе, удавалось обнаружить ко всем тестовым штаммам, при проведении ряда последовательных отборов проб. В то же время, в биологических образцах, отобранных на Украинской антарктической станции, обнаружены инфекционные фаги на тестовых бактериях. При этом, пробы, смытые с жабр рыб Черного моря, имели только литическую активность, без репродукции.

Показано, что резистентные к штаммам X. xndi v. bi IMV 7325, P.

ing v. fin IMV 1025, P. ing v. bi IMV 223, E. v IMV 216 (PP- bim vm) фаги образовывали рекомбинанты, способные лизировать новых хозяев. Сравнение геномов моноспецифичных фагов P. fin IMV 1025, из полевой коллекции, с лабораторными рекомбинантами, показало, что профили разделения фрагментов ДК HindIII всех образцов идентичны.

Указанные свойства фагов важно учитывать при их практическом применении, в частности, искусственном внесении в экосистему.

При построении экологических пирамид, у их основания размещают микроорганизмы и вирусы. Среди них вирусы бактерий, являются самыми многочисленными биологическими объектами на Земле [1], изучению роли которых не уделяется должного внимания. Данная работа представляет собой обобщение исследований, проведенных на протяжении продолжительного периода времени в лаборатории кафедры вирусологии Киевского национального университета имени Тараса Шевченко. Исследования были направлены на изучение особенностей экологии фагов активных против фитопатогенных бактерий, циркулирующих в агроценозах Украины.

В литературе нет данных об изменении числа бактерий на поверхности растений в биоценозах под влиянием фагов. Подобные данные приводятся для водных систем, где под влиянием фагов за сутки погибает до 20% бактерий, присутствующих в экосистеме [2]. Можно предположить, что в растительных биоценозах они также играют важную редуцирующую роль. Об этом свидетельствует широкое разнообразие фагов, выявляемых нами на поверхности растений. В исследованиях были использованы штаммы бактерий Xnmn, Ewini и Pdmn : P. ing v. IMV 185, P. vni v. i IMV 4013, P. ing v. IMV 8545, P. ing v. bi IMV 8646, P. viidiflv IMV 8867, P. vni v.

i IMV 4228, P. ing v. bi IMV 223, X. xndi v. bi IMV 7325, P.

ing v. mn IMV 7591, P. ing v. fin IMV 1025, P. i IMV 8612, P. ii IMV 8494, P. ing v. ing IMV 8653, E. v IMV 216(Pbim vm). Все тестовые культуры получены из музея фитопатогенных бактерий института микробиологии и вирусологии НАН Украины им Д. К. Заболотного. Обсуждаемые в данной работе фаги представляют собой полевые изоляты, полученные в нашей лаборатории.

Выделение полевых фагов из растительных биоценозов проводили, используя пробы, обладающие литической активностью к тестовым бактериям. Нам не удавалось выявить одновременно фаги, активные против всего списка используемых штаммов, при однократном заборе проб. Их обнаруживали ко всем используемым штаммам, при анализе проб, отбираемых с исследуемого участка, в динамике. Фаги смывали в 7 мл 0, 1 М Трис- НСl буфера (высечка 7 см2) с поверхности листовой пластинки. В одном миллилитре их содержание варьировало от единиц до 107 БОЕ/мл [3]. Последнее указанное значение оценивали, как максимально возможную концентрацию фагов фитопатогенных бактерий на поверхности растений в природных ценозах. Это количество способно вызвать полный лизис бактериальной культуры на газоне чашки Петри (площадь 70 см2). Более высокие титры фагов получают в лабораторных условиях, при их репродукции на хозяине, растущем на концентрированных питательных средах.



Для фагов, присутствующих на поверхности почвы в растительных экосистемах, ареал отдельной популяции занимает площадь около 2 см2 [4]. Его размер на поверхности растеБиология фагов ний исследователями не определялся. Косвенные данные, полученные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что, очевидно, ареал фагов фитопатогенных бактерий имеет подобные значения. Об этом свидетельствуют те данные, что в отдельных пробах, отбираемых на общем участке, количество фагов распределялось не равномерно, а дискретно, локальными популяциями. Они были представлены либо максимально возможными концентрациями (при лизисе доминирующего штамма на поверхности растения), либо минимальными (отдельные сохранившиеся инфекционные частицы или спонтанная продукция лизогенных бактерий).

Одним из этапов нашей работы была задача поиска уникальных генотипов фагов, имеющих широкий спектр литической активности против фитопатогенных бактерий. Такие фаги могли иметь практическую и коммерческую ценность. Необходимы были фаги, с уникальными свойствами, являющимися потенциально перспективными для защиты от бактериозов растений, произрастающих на Украине.

Мы предполагали, что большинство фагов, выделенных из определенной растительной экосистемы и внесенные в неё же, могли просто «растворяться», не оказывая желаемого эффекта. Обнаружение фагов с искомыми характеристиками могло быть связано с другими экосистемами. География распространения фагов фитопатогенных бактерий не освещена, в связи с чем, мы обратились к анализу наличия вирусов бактерий на одной из наиболее удаленных от Украины точек - Украинской антарктической станции (Аргентинские острова, климат субантарктический, морской, средняя температура летом около нуля) [5]. Исследования носили поисковый характер. Информации о присутствии фагов фитопатогенных бактерий на Аргентинских островах мы не имели. Острова имеют бедную растительность. Предполагалось, что концентрация фитопатогенных бактерий не может быть высока и, соответственно, вероятность выявления искомых фагов крайне мала. Даже в случае их обнаружения, фаги должны были бы присутствовать в крайне низкой концентрации и иметь ярко выраженные психрофильные свойства. Как указывалось выше, в зоне умеренного климата, наибольшая вероятность выявления высоких концентраций фагов существует при оптимальных для размножения фитопатогенных бактерий условиях, +25°С. Такая зависимость не соблюдалась при анализе образцов растений и почвы, отобранных в экосистеме Антарктиды []. В результате, в водных экстрактах мхов и почвы, на газонах четырнадцати тестовых украинских штаммов, выявляли широкий спектр фагов. Их наличие констатировали в 30% проб. Среди всего пула обнаруженных фагов, в 10% случаев титры достигали значений 10 БОЕ/мл []. Около 40% фагов «Антарктиды» удавалось вывести в стабильные линии, сохраняющие инфекционность при температуре +25°С. Такие значения сравнимы с данными, полученными для полевых фагов Украины [7].

Пул полученных фагов тестировали на наличие среди них генотипов с широким диапазоном хозяев. С этой целью, проводили их выращивание методом двухслойного агара, в чашке Петри, на газоне, представляющего собой смесь двух тестовых культур. На фоне мутных колоний искали прозрачные бляшки фагов, способные лизировать обоих хозяев. В результате, были выявлены прозрачные негативные колонии. Их последующее последовательное перенесение еще на два штамма позволило изолировать генотип, способный лизировать одновременно четыре штамма бактерий (X. xndi v. bi IMV 7325, P. ing v. fin IMV 1025, E. v IMV 216(Pbim vm), P. ing v. bi IMV 223). Таким образом, было установлено, что, поиск уникальных генотипов фагов в Антарктиде имеет свою перспективу.

До сих пор практически не изучался вопрос, о существовании границ распространения популяций фагов фитопатогенных бактерий. В частности, распространяется ли их география на прилегающие к наземным растительным биоценозам, морские акватории. В них фаги могли быть смыты дождевыми потоками и в результате эволюции, адаптироваться.

Для поиска ответа проводили анализ присутствия фагов фитопатогенных бактерий в соприкасающейся с растительными биоценозами Украины, акватории Черного моря. Как известно, максимальные концентрации вирусов у морских животных выявляют на фильтрующей поверхности, жабрах. Смывы из них использовали для анализа наличия фагов фитопатогенных бактерий. Было установлено, что около 40% образцов вызывали лизис тестовых бактерий.

Однако, все попытки вывести, путем пассажей такие фаги в стабильные инфекционные линии, не увенчались успехом. Фаги полностью инактивировались [8]. Очевидно, они являлись морскими фагами, способными вызывать лизис, за счет активности литических ферментов вирусов. Не исключено, что они могут выполнять важную роль, защищая жабры рыб от бактериальной инфекции. Полученные данные свидетельствуют в пользу того предположения, что в исследуемой акватории отсутствуют истинные фаги фитопатогенных бактерий.

В природе репродукция вирулентных фагов сопровождается полным лизисом хозяина. Образовавшаяся популяция фагов, при отсутствии чувствительного штамма постепенно уменьшается, а когда ее численность падает ниже критической, она инактивируется. В наших исследованиях (на моделях шести фагов фитопатогенных бактерий), было показано, что срок сохранения их биологической активности в биоценозе составляет около 14 дней [9]. Спектр литической активности у большинства полевых фагов узкий и способен инфицировать лишь несколько штаммов. Численность популяций может уменьшиться до критических значений и возникает угроза элиминации их из экосистемы. Однако, на практике, фаги широко распространены и стабильно присутствуют в биоценозах [10]. С поиском ответа на вопрос, каким образом обеспечивается постоянное присутствие узкоспецифических фагов в природе, мы столкнулись, при выделении фагов к штаммам : P. ii IMV 8494, P. ing. v. bi IMV 8646, P. vni v. i IMV 4013, P. ing v. IMV 8545.





Из полевых образцов нам не удавалось изолировать генетически стабильные линии искомых фагов. После пассажей они теряли инфекционность. Однако, мы исключали возможность того, что в природе какой-либо штамм не имеет своего природного ограничителя численности, коими являются фаги. Если мы не обнаруживали искомые фаги напрямую, то было решено получить их, как продукт рекомбинации. Для инфицирования использовали фаги, активные против других штаммов бактерий. На газонах, резистентных к используемым фагам, штаммов P. ii IMV 8494, P. ing. v. bi IMV 8646, P. vni v. i IMV 4013, P. ing v. IMV 8545. Их инфицировали 24 вариантами пар вирусов. В результате были обнаружены рекомбинанты [11]. Это свидетельствовало о том, что подобные события, вероятно, происходят и в природе. Одновременно, возникал вопрос, можно ли в таком случае, рассматривать генотипы рекомбинантных фагов, как биологический объект с устойчивыми характеристиками.

Для ответа на поставленный вопрос проводили сравнение полевых и рекомбинантных фагов, активных против штамма P. fin IMV 1025. Использование этого штамма было обусловлено тем, что все, выделенные в нашей лаборатории, к нему фаги были моновалентны. У нас поддерживается большая коллекция изолятов фагов. Они выделены в разные годы и в разных географических точках Украины. Фаги P. ing v. аfin IMV 1025 одного морфотипа, имели близкий белковый состав, а их геномы при рестрикционном анализе, при использовании фермента indIII идентичны. У фагов других бактерий такой строгой закономерности не наблюдали.

Для образования рекомбинантных фагов к P. fin IMV 1025 отбирали полевые образцы, содержащие фаги, способные образовывать на тестовом штамме пятна лизиса, но не дающих инфекционное потомство. Пары таких изолятов, при смешанной инфекции, в трех Биология фагов случаях из 48, образовывали стабильные рекомбинанты, 1025R1, 1025R2 и 1025R3. Сравнение геномов полевых штаммов и рекомбинантов проводили с помощью рестрикционного анализа, с применением эндонуклеазы рестрикции indIII. Было установлено, что профили разделения фрагментов ДНК всех сравниваемых фагов, как хранящихся в коллекции, так и полученных после рекомбинации, идентичны. Их ДНК содержала значительное количество сайтов узнавания indIII, что позволяет говорить о подобии их ДНК. Полученные результаты указывают на важную роль хозяев в процессе естественной эволюции фагов, нуждающуюся в дальнейшем изучении.

Таким образом, учет многофакторных взаимоотношений фагов и их хозяев, исследование экологии, разработка принципов селекции фагов, которые не сформулированы и устанавливаются в каждой лаборатории индивидуально, является необходимым условием для создания научно обоснованных подходов к решению важной задачи разработки экологически безопасных препаратов защиты растений, на основе вирусов бактерий.

1. Wommck K.E & olwell R.R. Virioplnkton: viruses in qutic ecosystems. Microiol //Mol. Biol. - 2000. - 4, № 1, - P. 9- 2. uttle. The significnce of viruses to mortlity in qutic microil communities // Microil. Ecology. - 1994, № 2, - P. 237- 3. Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І. Екологічні аспекти циркуляції фагів фітопатогенних бактерій у біоценозах //Екологічний вісник. Київ, - С. 498 – 4. Vos M., Birkett., Birch E., Griffiths R., Buckling.. Locl dpttion of Bcteriophges to Their Bcteril osts in oil // cience. - 2009. - 325. -. 5. Попов Ю.И., Скрыпник В.В., Тимофеев В.Е., Украинский В.В. Гидрофизические аномалии и их связь с метеорологическим режимом в районе Антарктической станции Академик Вернадский в течении летних сезонов 2000-2001 гг. //Украинский антарктический журнал.

- 2003, №1, - С. 79-. Бойко А.Л., Семчук Л.І., Войціцький В.М., Андрійчук О.М. Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І., Ващенко В.М., Делімат А. Виявлення фагів фітопатогенних бактерій в Антарктиді //Агроекологічний журнал. - 2003, №4, - С.12- 7. Андрійчук О.М., Семчук Л.І., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.А., Яцковська Л.І., Бойко А.Л. Динаміка виділення фагів фітопатогенних бактерій із листя та коренів цукрових буряків.

// Вісник КНУ. - Сер. Біол. - 2004. №42, - С. 49- 8. Семчук Л.І., Степанова О.А., Бойко А.Л., Андрійчук О.М. Виявлення фагів фітопатогенних бактерій у зябрах риб Чорного моря //Вісник КНУ. Сер. Біол. - 2003. №41, - С.15- 9. Ромашев С.А., Семчук Л.І., Андрійчук О.М., Ігнатенко Т.О., Яцковська Л.І., Колонюк І.О. Дослідження фагів фітопатогенних бактерій та їхнього впливу при внесенні на експериментальні ділянки з посівами цукрового буряку//Вісник КНУ. Сер. Біол. - 2005. №44, - С.

33- 10. Weinuer M. Ecology of procryotyc viruses. // FEM Microiology Revies. -2004. P.127- 11. Семчук Л.І., Ромашев С.А., Ігнатенко Т.О. Аналіз частоти рекомбінацій фагів фітопатогенних бактерій та їхня роль у природі. // Вісник КНУ Сер. Біол. - 200. №47, - C.3-

PARTICULAR QUALITIES ECOLOGY PHAGES OF PHYTOPATHOGENIC

BACTERIA, CIRCULATING IN AGROCENOSES OF UKRAINE

Semchuk L.I., Postoenko E.M., Romashev S.A.

Keywords: Big, g, gni bi, ni id, Rmbinn.

wini nd Pdmn. Pg in gi mmni, d b dd f in ding v niv ming. A m im, in bigi m kn Ukinin Ani in, bn dd g infin n bi. In ni mwd fm gi fi Bk, w bvd n i ivi, n din.

fin IMV 1025, P. ing v. bi IMV 223, E. v IMV 216 (Pbim - vm) g, fmd mbinn, wi b ing nw.

wi b mbinn, wd fi DNA HindIII -fgmn m idni. ding i f g i imn nid i i immnin, in i, ifii bing in m.

УДК 579.

ОСОБЕННОСТИ ВОЗРАСТНОЙ ДИНАМИКИ БАКТЕРИОФАГОВ

E.COLI КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА СВИНЕЙ

Скобликов Н.Э., кандидат медицинских наук ГНУ Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии (СКНИИЖ) тел. 8(918)4989891, skoblikow@yandex.ru Зимин А.А., кандидат биологических наук ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.Г.К.Скрябина 8(4967)730479, zimin@ibpm.pushchino.ru Ключевые слова: бактериофаги, E.i, свиньи, возрастная динамика Работа посвящена определению титра и разнообразия бактериофагов E.i в кишечi нике поросят первых месяцев жизни. Установлено: пик количества и разнообразия коли-фагов приходится на 27 день; динамика имеет тенденцию к снижению с титра 4,73 – 5,46 g БОЕ/г до неопределяемых значений к 66 дню; большую часть (89,7%) коли-фагов составляют фаги Т4-типа семейства Mviid.

В настоящее время исследованиям микробной экологии растущих животных посвящено уже значительное количество работ [1], однако в абсолютном большинстве они касаются рассмотрения бактериальной составляющей, в то время как рассмотрение бактериофагов, составляющих единую микроэкологическую систему с изучаемыми бактериями-хозяевами, Биология фагов остаётся практически без внимания исследователей. Такая ситуация особенно парадоксальна в отношении фагов E.i (коли-фагов), которых можно назвать самыми изученными (в т.ч. – и по причине их применения в качестве основы профилактических и терапевтических антибактериальных препаратов). Работы, посвящённые описанию фаговых профилей микробиоценозов животных [2; 3], крайне немногочисленны. Данное исследование позволит восполнить пробел в представлениях о детальной (с интервалом в несколько дней) возрастной динамике поросят первых месяцев жизни.

Материалы и методы исследований Для наблюдения было отобраны трое поросят, родившихся в один день потомков одной свиноматки породы СМ-1 и содержавшихся в одинаковых условиях на одинаковом рационе. Отъём поросят от свиноматок во всех группах проводился на 35-й день жизни.

У всех животных отбирались образцы содержимого толстой кишки в различном возрасте: на 17-й, 21-й, 24-й, 27-й, 31-й, 35-й, 39-й, 42-й, 4-й, 53-й, 59-й, -й день жизни (всего 12 раз, т.е., 3 образцов). Фекалии животных г) отбирались в одно и то же время суток (сразу после утреннего кормления около 800 – 900) в стерильные 20 мл контейнеры. Для определения титра коли-фагов образцы фекалий, отобранных в стерильный контейнер, взвешивали, после чего ресуспендировали в 10 мл буферного (50мМ трис; 10мМ ЭДТА) раствора (рН 8,0). После приготовления взвесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин, отбирали супернатант, переносили в другую пробирку, добавляли 0,3 мл хлороформа и перемешивали. Центрифугировали ещё раз при 3000 об/мин в течение 20 мин, отбирали супернатант, переносили его в третью пробирку и добавляли 0,1 мл хлороформа. Из полученной суспензии делали серию 100-кратных разведений в этом же растворе, из которых производили высев на культуры лабораторного штамма E. i B методом агаровых слоёв с использованием твёрдой и мягкой агаризованных сред LB [4]. После инкубирования при 37 в течение 18 ч производили отбор образовавшихся бляшек для дальнейшего исследования, учитывая их морфологические особенности и количество бляшко-образующих единиц (БОЕ) данных бактериофагов. Количественная оценка (титр) содержания бактериофагов E.i в исследуемом биоматериале осуществлялась путём подсчёта бляшек после первичного посева, выражая её в lg БОЕ/г.

Для качественной оценки спектра коли-фагов из чашек с посевом штамма E. i B и образовавшимися на них бляшками производили отбор чётких изолированных бляшек, отличавшихся наибольшим морфологическим разнообразием. Вырезанные бляшки вносили в пробирки с культурой соответствующего штамма, культивировали на жидкой среде LB при 37°С в течение,5 часов, после чего рост бактерий останавливали добавлением 0,1 мл хлороформа.

Полученную взвесь фагов и лизированных бактерий освобождали от клеточного детрита центрифугированием при 14500 об/мин в течение 5 мин.

Молекулярно-генетическую характеризацию бактериофагов осуществляли с применением метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специальными праймерами, позволяющими выявить наличие характеристических для фагов Т4-типа семейства Mviid генетических маркеров. К таким маркерам относятся ген 23, кодирующий основной белок головки фага (праймеры MZi1 и C8), ген 32 (праймеры FR60 и FR61) и ген (праймеры 1fR и CH), кодирующие иммуноглобулиноподобные белки поверхности фага.

Результаты исследований и их обсуждение В результате исследования оставшихся собранных 3 образцов биоматериала, подлежащего качественной и количественной оценке фагов E.i, было установлено, что в 7 образцах отсутствуют фаги, определяемые на культуре E.i B. В остальных 29 образцах было выделено 58 коли-фагов (от 1 до 3 фагов от одного образца), отличающихся друг от друга морфологическими особенностями бляшек. Характерно, что наибольшим разнообразием тиБиология фагов пов коли-фагов отличался период 27 дней, демонстрируя с 42 дня тенденцию к снижению разнообразия.

Количество коли-фагов, выделенных от одного животного в течение всех 12 возрастных периодов колебалось от 18 (животное III) до 20 (животные I и II). Что касается суммарного титра коли-фагов в каждом образце, то его динамика имела определённое сходство между животными. У всех животных график динамики титра коли-фагов имел следующие общие элементы: исходный (в 17 день) титр в пределах 4,73 – 5,4 lg БОЕ/г; снижение (в 24 день) до 3,00-4,28 lg БОЕ/г с последующим выравниванием; постепенное снижение (в 59 – дней) до неопределяемых значений (рис. 1).

Титр коли-фагов, lgКОЕ/мл Рис.1 - Динамика титра коли-фагов у поросят 3-9 недель жизни По результатам ПЦР-анализа на наличие генетических маркеров, характерных для фагов Т4-типа семейства Mviid, выяснилось, что бактериофаги различались наборами определяемых генов. Было установлено, что большая часть выделенных коли-фагов имела генетические маркеры принадлежности к фагам Т4-типа семейства Mviid. Так, из всех фагов 44 фага (75,9%) были положительны по обоим генам (ген 23 и ген 32), 8 фагов (13,8%) – по гену 23; отрицательными по обоим генам было фагов (10,3%). Примечательно, что ни один из 58 выделенных фагов не характеризовался генотипом «g23– g32+». Также интересно, что фаги не-T4-типа, обнаруживаясь до отъёма у всех трёх животных, после отъёма не обнаруT4-типа, живались. Примечательно, что ни один из 58 выделенных фагов не характеризовался генотипом «g23– g32+». Также интересно, что фаги не-T4-типа, обнаруживаясь до отъёма у всех трёх животных, после отъёма не обнаруживались (таблица 1).

Биология фагов Таблица 1 -Доля и популяционный состав коли-фагов Т4-типа семейства Mviid в кишечном микробиоценозе поросят 3-9 недель жизни Дополнительное типирование по наличию -гена помогло более детально дифференцировать фаги Т4-типа на субпопуляции. Так, всего было выявлено 10 -отрицательных фагов из 52 всех фагов Т4-типа (т.е., 19,2 % Т4-фагов). Однако, анализ конкретных фагов в группах животных лишь по трём генам не позволил решить вопрос об идентичности фагов с одинаковыми генотипами, определяемых в одном и том же образце. Также в целом неясным остался вопрос об идентичности фагов с одинаковыми генотипами, выделяющимися у одного и того же животного в разные временные периоды.

Однако, в данном случае, молекулярно-генетическая характеризация коли-фагов по трём различным генам позволила ответить на существенный вопрос динамики содержания бактериофагов E.i у отдельных животных, а именно: вызваны ли описанные выше периодические подъёмы титра коли-фагов одними и теми же или разными фагами? Из анализа данных видно, что подъёмы титра коли-фагов на 17-й, 31-й и 4-й дни могут быть обусловлены одним и тем же фагом у животного I, но у других животных вызваны разными фагами.

Проведённые исследования позволяют сделать следующие выводы:

1. В период с 17 до 31 день жизни в кишечном микробиоценозе поросят выделяется 2-3 коли фага (пик разнообразия приходится на 27 день), с 35 по 53 день – 1-2 фага, в возрасте дней коли-фаги не выделяются в определяемых количествах.

2. Титра коли-фагов кишечного микробиоценоза поросят в возрасте 17- дней имеет характерную динамику, в общем имеющую тенденцию к снижению с титра 4,73 – 5,4 lg БОЕ/г до неопределяемых значений.

3. Большую часть (89,7%) выделяемых в кишечном микробиоценозе поросят колифагов составляют фаги Т4-типа семейства Mviid; большинство из них положительны по генам 23, 32 и -гену.

1. olzpfel W.., ughton. J. Microil ecology in growing nimls / Elsevier. 2005.

522p.

2. llwy,T., Edrington,T., Vrey,., Ry,R., Brn,., Kutter,E., Jung,Y., Genovese,K., Elder,R., iset,D.J. (2003). Isoltion of nturlly occurring cteriophge from sheep tht reduce popultions of Eii i O157:7 In Vi nd In Viv. 5 Innin mim n ‘ig Txin(Vxin) - Pding Eii i Infin’, O-1.

3. Golomidov,., Kulikov, E., Isev,., Mnykin,., Letrov,. (2007) The Diversity of oliphges nd oliforms in orse Feces Revels omplex ttern of Ecologicl Interctions.

ppl.Environ.Microiol. 73(19) 5975–5981.

4. mrook J., Frith E.F., Mnitis T. Moleculr cloning: lortory mnul / old pring ror L. ress. 1989. 480 p.

FEATURES OF AGE DYNAMICS OF E.COLI PHAGES OF INTESTINAL

MICROBIOCENOSIS OF PIGS

ig in fi mn f if. Ebid: qni nd divi k f i-g dd d; g dnmi nd f ding fm 4,73 – 5,46 g PFU/g i ndd v d; m (89,7%) f i-g ni f Т4- g f Mviid fmi.

УДК 602.3:579.

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТ

БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS MYCOIDES

Феоктистова Н. А.*, кандидат биологических наук, доцент тел. 8(8422) 55-95-47, feokna@yandex.ru тел. 8(8422) 55-95-47, usxa@yandex.ru Васильев Д.А.*, доктор биологических наук, профессор 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Алешкин А.В.**, доктор биологических наук 8-495-452-18-16, ava@gabri.ru *ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

**Московский НИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского»

Ключевые слова: Бактериофаги, Bi mid, биопрепарат, литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, изменение литической активности при хранении.

В статье дана характеристика некоторых биологических свойств бактериофагов Bi mid (литическая активность, спектр литического действия, специфичность действия, изменение литической активности при хранении). а основании изученных свойств были выбраны фаги для конструирования биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентификации бактерий Bi mid в пищевом сырье и продуктах питания.

Введение. Создание биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентикации бактерий Bi mid в пищевом сырье на основе бактериофагов подразумевает изучение таких биологических свойств, как литическая активность, спектр литического действия, специфичность в пределах вида и изменение литической активности при хранении [3,5].

Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или плотных питательных средах и выражает это тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки литической активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Однако, этот показатель отБиология фагов носительный, так как активность фага зависит от различных условий, основными из которых являются биологические особенности бактериальной клетки, которые в свою очередь зависят от физических свойств среды, ее химического состава, окружающей температуры и так далее.

Поэтому активность фага всегда определяется в конкретных, стандартных условиях [4]. Видовая специфичность фагов используется в практике для дифференциации бактерий. Эта способность фагов определяется, прежде всего, родством их к рецепторам лизируемых бактерий [2]. Так как для разработки технологических параметров изготовления биопрепарата на основе фагов необходимо изучить изменение литической активности при хранении, так как срок годности биопрепарата начинает исчисляться с момента наработки фага и его укупоривания в герметично закрытые флаконы [7].

Целью наших исследований было изучение основных биологических свойств бактериофагов Bi mid (литическая активность, спектр литической активности, специфичность действия, изменение литической активности при хранении).

Материалы и методы исследований В работе было использовано 12 штаммов бактерии Bi mid, 1 из них референс – штамм (Bi mid 537). Использовали также 78 штаммов бактерий Bi, Bi mgim, Bi mni, Bi bii, Bi ingini, полученных из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина». Изучались биологические свойства 5 изолятов бактериофагов Bi mid, выделенных из объектов санитарного надзора Ульяновской и Самарской областей, Краснодарского края.

Изучение биологических свойств бактериофагов проводили методами, предложенными Д.М. Гольдфарбом [2], И.П. Ревенко [], В.Я. Ганюшкиным [1], С.Н. Золотухиным [3].

Результаты собственных исследований и их обсуждение Изучения литической активности селекционированных фагов Bi mid проводили методом агаровых слоев (Grci, 193) []. Накануне опыта по чашкам Петри разливали 1,5% мясопептонный агар в ламинарном боксе. Перед использованием чашки дополнительно подсушивали в термостате при 37 0С 15-20 минут. Индикаторные культуры Bi mid выращивались в условиях термостата в течение 18-20 часов при 37 0С на мясо-пептонном бульоне. Стерильный 0,7% мясопептонный агар, разлитый в пробирки по 2,5 мл, расплавляли на водяной бане и остужали до 4-48 0С. Исследуемый на присутствие бактериофага субстрат в количестве 1,0 мл помещали в 2,5 мл 0,7% мясопептонного агара, туда же вносили 0,2 мл индикаторной культуры. Все быстро и тщательно перемешивали вращением пробирки в ладонях и выливали на поверхность 1,5% мясопептонного агара. Смесь осторожными движениями распределяли по поверхности мясопептонного агара, чашки Петри оставляли на горизонтальной поверхности стола до полного застывания мясопептонного агара, затем инкубировали посевы в термостате при 37 0С в течение 18 часов. Экспериментальным путем установлено, что литическая активность фагов колеблется в диапазоне от 10 до 10 12 БОЕ/мл.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Важной характеристикой фагов Bi mid является диапазон их действия на штаммы бактерий в пределах вида. Для изучения спектра литического действия селекционированных фагов использовали 10 штаммов бактерий Bi mid, выделенных нами их проб пищевого сырья и продуктов питания и 1 штамм, полученный из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.

Столыпина». Исследования проводили методом нанесения фага на газон бактериальной культуры методом «стекающая капля». Экспериментальным путем установлено, что изучаемые специфичные бактериофаги имеют различный диапазон действия по отношению к 12 изучаеБиология фагов мым штаммам Bi mid (рис. 1). Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса которых составил 91,7 %. Вышеназванные фаги обладают перекрестным лизисом, в данном случае они лизируют следующие штаммы Bi mid, выделенные нами из пищевого сырья: Bi mid (пряности – мускатный орех), Bi mid 2 (картофель), Bi mid 5 (лук репчатый), Bi mid (рыба прудовая), Bi mid Н (пряности – корица) и референсштамм Bi mid 537.

Рис. 1 – Спектр литического действия фагов Bi mid Важнейшей характеристикой фага, входящего в состав биопрепарата для индикации и идентификации бактерий, является его специфичность в пределах вида. Изучение специфичности 5 выделенных изолятов бактериофагов Bi mid мы проводили на культурах гомологичного рода: Bi bii – 25 штаммов, Bi mni – 20 штаммов, Bi mgim – штаммов, Bi – 25 штаммов, Bi ingini – 4 штамма. Эксперимент ставили, используя методику, описанную С.Н. Золотухиным (2007).

Таблица 1 - Результаты исследований спектра литического действия и литической активности фагов бактерий Bi mid На чашки Петри с разлитым в нее 1,5% накануне мясопептонным агаром наносили газон культуры вышеназванных видов бактерий рода Bi. Бактериальный газон подсушивали в условиях термостата в течение 20-30 минут при 37 0С. Затем чашку Петри с подготовленным газоном делили на три сектора: две «опытных» дорожки и контроль на механическое повреждение газона. На «опытные» дорожки наносили по 1-2 капли исследуемого бактериоБиология фагов фага Bi mid, на «контрольную» дорожку – стерильный мясопептонный бульон в том же количестве, что и бактериофаги. Посевы помещали в термостат на 18 часов инкубации при 37 0С.

На чашках Петри, засеянных культурами Bi bii, Bi mni, Bimgim, Bi, Bi ingini, зон лизиса, при нанесении селекционированных нами фагов Bi mid B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА на газон культур, обнаружено при визуальном осмотре не было. Полученные результаты свидетельствуют, что выделенные и селекционированные нами бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bi mid и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bi mid.

Для конструирования биопрепарата нами было отобрано два фага B.myc–3 и B.myc– серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром литического действия (рис. 2).

Последующие эксперименты были направлены на изучение изменения литической активности укупоренных во флаконы бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, хранящихся в условиях холодильника в течение 12 месяцев. Показатели литической активности фагов при хранении определяется по классической методике определения активности методом агаровых слоев (Grci, 193). Для получения достоверных данных каждый эксперимент проGrci,, водили троекратно и результаты исследований подвергали статистической обработке. Эталонные культуры бактерий Bi mid выращивали на мясо-пептонном бульоне в течение часов в термостате при 37 °С. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Рис. 2 – Диапазон лизиса фагов В.myc-3 и В.myc-5 серии УГСХА Опытным путем установлено, что в течение 3 месяцев показатели литической активности исследуемых бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА оставались без изменений,,2х ± 0,8 х1012 и 1,х1010 ± 0, х1010 БОЕ/мл фаголизата, соответственно.

Через месяцев литическая активность снижалась и составила у фага B.myc– 4,7х10 ±1,5х108 БОЕ/мл и у B.myc–5 УГСХА - 2,5х108±1,7х108 БОЕ/мл, через 9 месяцев х107±0,2х107 и 1,1х108±0,4х108 БОЕ/мл, 12 месяцев - 0,4х107±0,1х107 и 1,3х107±0,5х107 БОЕ/мл, соответственно.

Экспериментально установлено, что пассирование бактериофагов на исходном штамме бактерий Bi mid в течение 7 пассажей методом агаровых слоев (Grci, 193) восстаGrci, навливает литическую активность бактериофагов на 1 порядок.

Таблица 2 – Изменение литической активности фагов В.myc-3 и В.myc-5 серии УГСХА при хранении Бактериальная культура Литическая активность, количество Bi mid 537/ В.myc-3 УГСХА Bi mid / В.myc-5 УГСХА Заключение. Проведенные исследования по изучению биологических свойств фагов Bi mid показали, что изучаемые бактериофаги именют различные показатели литической активности, определяемые в стандартных условиях. Литическая активность фагов B.myc– - B.myc–5 серии УГСХА колеблется в диапазоне от 10 до 10 12 БОЕ/мл. Опыты демонстрируют, что наиболее широким спектром литического действия по отношению к изучаемым культурам обладают штаммы фагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, совокупный процент лизиса исследованных штаммов Bi mid которых составил 90,9 %. Установлено, что выделенные и селекционированные нами бактериофаги, строго специфичны в пределах вида Bi mid и могут быть компонентами биопрепарата для индикации и идентификации бактерий Bi mid.

Для конструирования биопрепарата для фагоиндикации и фагоидентификации Bi mid нами было отобрано два фага B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, которые характеризовались высокими титрами литической активности и максимально широким совокупным спектром литического действия. Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение изменения литической активности укупоренных во флаконы бактериофагов B.myc–3 и B.myc–5 серии УГСХА, хранящихся в условиях холодильника в течение 12 месяцев. Определено, что бактериофаги в течение 12 месяцев снижали показатели литической активности с 1012 до 107 БОЕ/мл. Согласно данным С.Н. Золотухина (2007), изменение литической активности фагов в диапазоне 107-109 не является критическим при конструировании биопрепарата и не отразится на его способности лизировать культуры в пищевом сырье и продуктах питания при проведении исследований по их индикации и идентификации [3].

1. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии / В.Я. Ганюшкин. – Ульяновск: УГСХА, 1988. С.42–45.

2. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия // Д.М. Гольдфарб. – М.: Медгиз,191. С. 19–187.

3. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: автореф. дис. … докт. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 / Золотухин Сергей Николаевич. Ульяновск, 2007. С.32.

4. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир, 2012. С. 35-39.

5. Раутенштейн, Я.И. Изменчивость Bi mid. Морфология вариантов/ Я.И. Раутенштейн // Микробиология. 1977. №1 (1). С.33–41.

. Ревенко, И.П. Бактериофаги и их использование в ветеринарной практике / И.П. Ревенко. – Киев: Урожай, 1978. С. 41–88.

Биология фагов 7. Юдина, М.А. Диагностика картофельной болезни хлеба, вызываемой бактериями видов Bi bii и Bi mni / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, Е.О. Бахаровская [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2011. – №1 (13). –. 1–7.

CHARACTERISTICS OF SOME BIOLOGICAL PROPERTIES

BACTERIOPHAGES BACILLUS MYCOIDES

Feoktistova N.A., Makeev V.A.,Vasilyev D.A., Aleshkin A.V.

f i ivi, ifii, mdifiin f i ivi ding g.

Bi mid (i ivi m f i in, ifii, mdifiin f i ivi d f fgindikii nd fgidnifikii bi Bi mid in fd w mi nd fd d.

УДК 602.3:579.

ФАГОИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS CEREUS

Феоктистова Н. А.*, кандидат биологических наук, доцент тел. 8(8422) 55-95-47, feokna@yandex.ru тел. 8(8422) 55-95-47, usxa@yandex.ru Васильев Д.А., доктор биологических наук, профессор 8(8422) 55-95-47, dav_ul@mail.ru Алешкин А.В.**, доктор биологических наук 8-495-452-18-16, ava@gabri.ru *ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина»

**Московский НИИЭиМ им. Г.Н. Габричевского»

Ключевые слова: бактериофаги, Bi bii, Bi, лизис, корма, пищевые продукты, фагоидентификация Описана схема исследования проб пищевых продуктов и продовольственного сырья с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий Bi bii и Bi с использованием выделенных и селекционированных строго специфичных бактериофагов Bi bii и Bi в сравнении с классической схемой выделения и идентификации бактерий рода Bi по Gdn (1973).

Введение. Роль бактериофага как средства терапии и профилактики некоторых инфекционных заболеваний в настоящее время невелика, а значение для лабораторной диагностики ряда инфекции этот биологический объект не только не утратил, а, наоборот, начал привлекать к себе все более пристальное внимание исследователей [1,3,5].

С каждым годом повышается значимость бактериофагов как высоко специфического диагностического средства, позволяющего надежно дифференцировать возбудителей бактериальных видов, а порой проводить более детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри данного вида [2,7]. Возможность фагоидентификации вытекает из специфичности действия фагов, которая может быть настолько выражена, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и серологически неотличимые штаммы в пределах одного вида [4]. Поэтому все большее число исследователей предпочитают обращаться к фаговым тестам, как единственному средству, способному дифференцировать близкородственные штаммы [2,8,9].

Материалы и методы. В исследованиях использовали фаги Bi bii Bs-13, Bs-1, фаги Bi Вс-4, Вс-8 серии УГСХА; водопроводную воду, комбикорм, мясо, пряности, которые контаминировали штаммами бактерий Bi bii (Bi bii 6633, Bi bii 2) и Bi (Bi 2527, Bi 8035) в концентрации 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 м.к./мл., полученными из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина».

Используя строгую родовую и видовую специфичность селекционированных бактериофагов, нами была разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bi bii и Bi. Подготовку и посев проб кормов и пищевых продуктов, подлежащих исследованию, проводили в соответствии ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб» [10] и ГОСТ 29-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов» [11].

Результаты исследований и их обсуждение. Для искусственной контаминации пробы воды (мяса, комбикорма и пряностей) объемом (весом) 10 мл (г) вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали стерильным МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл (г) исследуемой пробы. В колбы вносили индикаторные культуры в концентрации 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 м.к./мл (г). Полученные смеси встряхивали в шуттельаппарате в течение 15 минут и ставили в термостат на 24 часа при 37°С. Затем надосадочную жидкость исследовали в соответствии со схемой, представленной на рис.2.

Первоначально производили посев по МПА по методу Дригальского для выделения чистой культуры Bi bii и Bi, а затем производили посевы на среду Гаузе № 2 и среду Громыко. Инкубировали посевы в условиях термостата в течение часов в условиях термостата при 37°С. Затем выросшие колонии пересевали на МПБ и инкубировали в условиях термостата в течение 18 часов в условиях термостата при 37°С. Следующим этапом наших исследований было изучение биологических свойств выделенных культур по тестам, отраженным на рис.1. Результаты исследований представлены в таблицах 1 и 2.

В основу приведенной ниже схемы оценки диагностических признаков выделенных бацилл положены принципы, изложенные в работах R. Gordon [13] автора систематики рода Bi в последних изданиях определителя бактерий Bergey [12].

Бульонные культуры, полученные после пересева колоний с вышеперечисленных сред на МПБ, микроскопии (окраска по Граму) и при наличии в мазках грамположительных палочек с закругленными концами, располагающихся одиночно и попарно, подвергали фагоидентификации.

На поверхность МПА в чашках Петри пастеровской пипеткой наносили 3- капли бульонной 18-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки ставили в термостат для подсушивания на 15-20 минут.

Чашку делили бактериологическим карандашом на три сектора. На поверхность засеянной среды, в зоне первого сектора, пастеровской пипеткой легким прикосновением капли наносили фаг Bs-13 УГСХА, на второй сектор аналогично наносили Биология фагов фаг Bs-1 УГСХА, на третий сектор в качестве контроля наносили стерильный МПБ.

Наклоняли чашку, чтобы капли стекли в виде дорожки. Чашки оставляли для подсушивания в боксе на 15-20 минут и помещали в термостат на 18 часов при 37°С. По аналогичной методике изучали работу цереусных бактериофагов Вс -4 и Вс-8 серии УГСХА.

Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат - отсутствие лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствие лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к виду Bi bii или Bi.

Результаты опытов представлены в таблице 3.

Рис.1 - Схема выделения и дифференциации бактерий Bi bii и BiТаблица 1 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bi bii и Bi на среде Гаузе № Количество микробных Количество микробных Количество микробклеток в 1 гр (мл), проба клеток в 1 гр (мл), проба ных клеток в 1 гр Объекты Примечание:

«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.

Таблица 2 - Результаты исследований объектов санитарного надзора на наличие бактерий Bi bii и Bi на среде Громыко Количество микробных Количество микробных Количество микробных Объекты клеток в 1 гр (мл), проба клеток в 1 гр (мл), проба клеток в 1 гр (мл), проба Примечание:

«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.

Таблица 3 - Фагоидентификация бактерий Bi bii бактериофагами Bs-13 и Bs-16 серии УГСХА и бактерий Bcis cereus бактериофагами Вс-4 и Вс- серии УГСХА Результат воздействия фагов Bs- Результат воздействия фагов Вс- Объекты Примечание:

«+» - положительный результат, «-» - отрицательный результат.

Заключение. Фагоидентификация бактерий Bi bii бактериофагами Bsи Bs-1 серии УГСХА и бактерий Bi бактериофагами Вс-4 и Вс-8 серии УГСХА дала положительные результаты: из всех исскуственно контаминированных бактериями Bi bii и Bi проб пряностей, комбикорма, водопроводной воды и мяса были выделены культуры, которые при взаимодействии с вышеуказанными фагами были лизированы ими. При получении отрицательных результатов фагоидентификации необходимо проведение детального изучения ферментативных, серологических и патогенных свойств выделенных микроорганизмов. На рисунке изображена схема фагоидентификации бактерий вида Bi bii и Bi.

Она представлена в сравнении с традиционной схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы [13], изложенной в «Определителе бактерий Берджи» [12]. Доказано, что время исследований в соответствии с разработанной нами схемой короче на 71 час с меньшими затратами посуды и реактивов Биология фагов Рис. 2 - Схема ускоренной идентификации бактерий вида Bi bii и Bi с помощью селекционированных нами бактериофагов (I) в сравнении со схемой выделения и дифференциации бацилл первой морфологической группы, изложенной в «Определителе бактерий Берджи».

1. Адамс, М. Бактериофаги / М. Адамс. – М., Медгиз, 191. – С. 2-121.

2. Адельсон, Л.И. Бактериофаги, активные по отношению к энтеропатогенным кишечным палочкам / Л.И. Адельсон // Вопросы микробиологической диагностики и бактериофагии.

– М., 192. – С. 184-194.

3. Габрилович, И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. – Минск, 1973. – С.5 – 24.

4. Габрилович, И.М. Биологические свойства бактериофагов errti mrcences / И.М.

Габрилович // ЖМЭИ. – 1992. – №. – С.10-12.

5. Ганюшкин, В.Я. Бактериофаги сальмонелл и их применение в ветеринарии/ В.Я.

Ганюшкин //. – Ульяновск. – 1988. – С.. Гольдфарб, Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб. – М.: Медгиз,191. – С. -18.

7. Егоров В.В. Практикум по микробиологии / В.В. Егоров. – М.: Изд-во МГУ, 198. С. 35-42.

8. Клевакин, В. М. Санитарная микробиология пищевых продуктов / В.М. Клевакин, В.В. Карцев. – Л.: Медицина, 198. – С. 14.

9. Смирнов, В.В. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ / В.В. Смирнов, С.Р. Резник, И.А. Василевская. - Киев: yкова Думка, 1982. - С. 117-120.

10. ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб».

11. ГОСТ 29-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

12. Bergey’s mnul of determintive cteriology, Willims nd Wilkins o, Bltimore, Md., 8th ed., 1974. - 124 p. 191.

13. Gdn, R. The genus Bi / R. Gdn // In: nd. Microiol. levelnd (Ohio). - 1973. - V.l. -.71-88.

FAGOIDENTIFIKATSII BACILLUS SUBTILIS BACTERIA

AND BACILLUS CEREUS

Feoktistova N.A., Kaldirkaev A.I., Vasilyev D.A. Aleshkin A.V.

fgidnifiki id idnifiin f bi Bi bii nd Bi wi ddid nd f i ifi big f Bi bii nd Bi in min wi i m f iin nd idnifiin f bi f gn Bi b Gdn (1973).

Бактериофаги в медицине и ветеринарии УДК 615.375(06):616.981.49-053.

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИММУННОГО ЛАКТОГЛОБУЛИНА

НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К БАКТЕРИОФАГАМ САЛЬМОНЕЛЛ,

ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ, В ОПЫТАХ IN VITRO

Алексанина Н.В., кандидат биологических наук, ФБУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии Тел.8(863)234-29-33, nataly10_09@mail.ru Ключевые слова: Бактериофаги, сальмонеллы, иммунный лактоглобулин.

Исследована чувствительность к бактериофагу клинических штаммов рода mn, выделенных от детей первых лет жизни, больных сальмонеллезом. Получено штаммов: 26 штаммов –.imim и 20 штаммов.niidi. Все культуры обладали высокой антибиотикорезистентностью и разной степенью чувствительности к сальмонеллезному бактериофагу. Показано, что воздействие иммунного лактоглобулина приводит к восстановлению чувствительности сальмонелл к бактериофагу, в опытах in vi.

Введение. Острые кишечные инфекции ( ОКИ ),вызванные антибиотикорезистентными штаммами сальмонелл, занимают ведущее место в патологии детей первых лет жизни.

Сальмонеллезы относятся к разряду внутригоспитальных и протекают в виде ограниченных вспышек или разрозненных спорадических заболеваний. Наиболее часто возбудителями сальмонеллезов у детей являются.typhimurium и.enteritidis. Летальность при этих инфекциях достигает 30-0%. Вместе с тем, лечение данного заболевания затруднено высокой частотой ( 0-95% ) антибиотикорезистентности, проявлением токсических и многочисленных аллергических реакций, а также осложнениями в виде явлений дисбактериоза( 1,2).

В современной детской гастроэнтерологии используется широкий арсенал препаратов для коррекции нарушенного микробиоценоза кишечника. В связи с широким распространением лекарственноустойчивых форм возбудителей в последнее время возрос интерес к бактериофагам, которые используют для антибактериальной терапии, альтернативно приему антибиотиков. В отличие от химиотерапевтических лекарственных средств бактериофаги оказывают специфическое направленное действие строго в отношении соответствующих микроорганизмов, не причиняя вреда нормальной микрофлоре, сочетаются с любыми лекарственными средствами(3,4).

Разработанный в Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии совместно с ВНИИВС им.Мечникова и Нижегородским НИИЭМ им.И.Н.Блохиной пероральный препарат “ Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл” представляет собой стерильную лиофилизированную иммуноглобулиновую фракцию молозива коров (Ig G, Ig A, Ig M до 9 % состава препарата) и предназначен для лечения детей с дисбактериозами и острыми кишечными инфекциями, вызванными сальмонеллами, клебсиеллами, протеем, псевдомонадами и их ассоциациями. Препарат обладает антибактериальным, антитоксическим, антиадгезивным, иммуномодулирующим действием,содержит бифидогенный фактор, не токсичен.

Совместим с антибиотиками и бактериофагами, препаратами нормофлоры (5,).

В данной работе исследована чувствительность к фагам бактерий рода lmonell, выделенных от детей с ОКИ, изучено влияние иммунного лактоглобулина на фагочувствительность этих микроорганизмов, в опытах in vitro.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследований явились штаммов сальмонелл (2 штаммов.typhimurium и 20 штаммов.enteritidis); бактериофаг сальмонеллезный групп А,В,С,Д,Е жидкий (раствор для приема внутрь и местного применения); лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл, выпускаемый в РНИИМП с 1994 года.

Чувствительность микроорганизмов к бактериофагу проводили путем нанесения капли препарата (0,01 мл) на газон –test штамм (‘’ pot- test’’). Учет степени лизиса бактерий регистрировали по четырех крестовой схеме.

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе исследования было получено 4 штаммов рода lmonell ( 2 шт.-.typhimurium и 20шт.-.enteritidis), выделенных от деenteritidis), тей больных сальмонеллезом. Все выделенные культуры обладали высокой антибиотикорезистентностью и были чувствительны к сальмонеллезному бактериофагу. Однако, из 4 исследованных штаммов сальмонелл к 32 культурам (70%) активность сальмонеллезного бактериофага была высокой и оценена нами на 4 креста (через 18-20 часов наблюдали полный лизис бактерий ), к 11 культурам (30%) – 8 штаммов.enteritidis и штаммов S.typhimurium активность сальмонеллезного бактериофага была низкой и оценена нами 1и 2 креста.

Обязательным условием эффективности фагирования является чувствительность возбудителя к бактериофагу и степень его литической активности.

Для изучения влияния иммунного лактоглобулина на фагочувствительность сальмонелл отобрали клинические изоляты бактерий рода lmonell ( 11 штаммов) :8 штаммов.enteritidis и штаммов.typhimurium активность фага к которым была низкой. Культуры пасenteritidis.typhimurium сировали в 5% растворе лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл в течение 15 дней, что соответствовало схеме терапевтического применения препарата для лечения больных ОКИ. Параллельно в качестве контроля проведены пассажи тех же штаммов в мясопептонном бульоне (МПБ). У полученных в процессе пассирования культур ( 5,10,15 пассажи) и их исходных вариантов изучали чувствительность к сальмонеллезному бактерифагу.

Результаты проведенных исследований показали, что при пассажах сальмонелл в иммунном лактоглобулине чувствительность культур к сальмонеллезному бактериофагу восстанавливалась и оценена нами на 4 креста ( наблюдали полный лизис бактерий через 18- часов) уже после 5-го пассажа сальмонелл в лактоглобулине. Активность фага в отношении культур, пассированных в МПБ, оставалась прежней..

Заключение. Проведенные исследования показали, что сальмонеллы, выделенные от детей раннего возраста, характеризовались разной степенью чувствительности к бактериофагу. Сальмонеллезный бактериофаг проявлял высокую активность в отношении 70% антибиотикорезистентных штаммов сальмонелл, к 30% культур активность фага была низкой.

В опытах in vitro установлено, что при воздействии лактоглобулина на сальмонеллы с низкой фагочувствительностью происходит восстановление чувствительности у культур к сальмонеллезному бактериофагу уже после 5-го пассажа их в препарате.

1.ВоротынцеваН.В.,МазанковаЛ,Н.Острые кишечные инфекции у детей // М. ‘’ Медицина’’, 2001,с.477.

2. Ворошилова Н.Н., Боговазова Г.Г., Казакова Т.Б., Перепанова Т.С., Дарбеева О.С. // Бактериофаги в медицине и ветеринарии Актуальные вопросы разработки и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Материалы всероссийской конф. – Уфа.2000.-с.87-94.

3. Приворотский В.Ф., Лупова Н.Е., Шильникова О.В.// Логика построения коррегирующих медикаментозных программ нарушенного микробиоценоза кишечника у детей.

РМЖ.2007.№1.с.-9.

4. Суворова М.А., Рябчук Ф.Н. Чувствительность микробиоты кишечника к бактериофагам и пробиотикам у детей с заболеваниями органов пищеварения // Педиатрия. №.2011.

5. Соболева С.В. Лактоглобулины – препараты нового поколения для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и дисбактериозов у детей.// Актуальные вопросы инфекционной патологии. Материалы юбилейной н/п конференции, посвященной 100-летию РНИИМП, 23-24 сентября 2009г. Ростов-на-Дону. С.251-255.

. Алексанина Н.В., Соболева С.В. Микробиоценоз толстого кишечника детей с диарейными заболеваниями в процессе лечения лактоглобулином против условно-патогенных бактерий и сальмонелл.// Там же. С.302-305.

THE STUDY OF INFLUENCE OF THE IMMUNE LACTOGLOBULIN

ON THE SUSCEPTIBILITY TO BACTERIOPHAGES OF SALMONELLA

ISOLATED FROM CHILDREN IN EXPERIMENTS IN VITRO

mni in fi f i, big, w invigd. T w nivd 46 in f.imim nd 20 in.niidi. A d ig nibii in nd diffn dg f niivi mn big. I bn wn infln f immn gbin d in f niivi f mn big, in ximn in vi.

УДК 616.932:576.858.

РАЗРАБОТКА ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ ХОЛЕРНЫХ

БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ

ВИБРИОНОВ

Аленкина Т.В., кандидат медицинских наук, Коровкина Г.И., кандидат медицинских наук, Никифоров А.К., кандидат медицинских наук, доцент ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Роспотребнадзора, г. Саратов тел. 8(8452) 51-69-65, microbe@san.ru Ключевые слова: бактериофаги, фаготипирование, лиофилизация, холера, энтеропатогенные вибрионы Работа посвящена разработке режимов лиофилизации, выбору стабилизирующей среды для получения сухих препаратов бактериофагов диагностических холерных ТЭПВ-1Определены физико-химические свойства лиофилизированных бактериофагов, оценена их диагностическая значимость, установлен минимальный срок годности.

Опыт эпидемиологических расследований выявил существенную роль в этиологии кишечных заболеваний человека штаммов Vibi не О1/не О139 серогрупп, близких по многим таксономическим признакам к возбудителю холеры [3, ]. Клинические заболевания, вызываемые холерными вибрионами не О1/не О139 серогрупп, так называемыми энтеропатогенными, протекают по типу острых гастроэнтеритов, энтероколитов, токсикоинфекций в ряде случаев по клинике и тяжести проявления подобных холере. Заболевания чаще носят спорадический характер, однако регистрируются и крупные вспышки с алгидными формами.

В большинстве своем энтеропатогенные вибрионы способны продуцировать термолабильный токсин, сходный с холерным энтеротоксином, цитолизин, гемолизин, термостабильные токсины, ответственные за развитие диареи. Описаны отдельные штаммы V. не О1/не О139, продуцирующие холерный токсин и содержащие в геноме ctx-ген, например штаммы относящиеся к О9, О13, О28, О37, О41 серогруппам [3, 5]. Все это свидетельствует об актуальности эпидмониторинга и правильной диагностики заболеваний вызванных энтеропатогенными вибрионами.

Большую роль в решении указанных задач играют препараты бактериофагов, строгая специфичность которых позволяет проводить индикацию, дифференциацию и фаготипирование бактериальных культур, выделенных из объектов внешней среды. Фаготипирование позволяет не только определить видовую принадлежность изучаемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Этот метод широко применяется в микробиологической практике для идентификации выделенных культур, а также имеет большое значение для эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний: установление источника инфекции и путей ее передачи.

Наиболее распространенный подход фаготипирования базируется на выявлении спектра чувствительности выделенной культуры к набору стандартных типовых фагов. Так в РосНИПЧИ «Микроб» выпускается набор «Бактериофаги диагностические холерные ТЭПВ-1, ТЭПВ-2, ТЭПВ-3, ТЭПВ-4, ТЭПВ-5, ТЭПВ-, ТЭПВ-7, раствор для диагностических целей»

(далее ТЭПВ-1–7), предназначенный для фаготипирования и фагодиагностики вибрионов неагглютинирующихся холерной О1 сывороткой, выделяемых от людей и из объектов внешней среды. Бактериофаги в жидком виде имеют ограниченный срок годности (1–2 года), быстро реагируют на изменения температурного режима при транспортировании и хранении, как в сторону повышения, так и понижения (замораживание). Стабильными свойствами и длительным сроком годности характеризуются лиофилизированные бактериофаги [1, 2]. Исходя из этого, целью наших исследований была разработка технологии лиофилизации бактериофагов ТЭПВи определение физико-химических и биологических характеристик сухих препаратов.

Материалы и методы исследований. Бактериофаги ТЭПВ-1–7 выращивали на соответствующих штаммах-продуцентах в бульоне Мартена рН 7,±0,1 при температуре (37±1) С.

Лиофилизации подвергались бактериофаги ТЭПВ-1–7, содержащие от 2х108 до х109 БОЕ/мл.

Поскольку выживаемость фагов в процессе лиофилизации зависит от состава среды высушивания, которая должна обеспечивать равномерное обезвоживание материала при сублимации [1, 2, 7], в качестве стабилизаторов выбраны 8 вариантов сред: 1 – пептон 10 %, желатин 1,5 %, натрия глутамат 5 %; 2 – пептон 10 %, желатин 2 %; 3 – натрия глутамат 10 %; 4 – лактоза 20 %; 5 – сахароза 25 %, крахмал 2 %; – раствор бессолевого пептона 5 %; 7 – пептон 5 %, желатин 0,7 %; 8 – сахароза 10 %, желатин 1,5 %. Защитные среды перед лиофилизацией Бактериофаги в медицине и ветеринарии соединяли с бактериофагами в соотношении 1:1.

Результаты предварительных экспериментов по отработке режимов лиофилизации позволили установить в качестве оптимального 24-часовой режим, при этом продолжительность периода сублимации составляла (5±1) ч, десорбции – (19±1) ч.

Специфическую активность (концентрацию фаговых частиц и спектр литической активности) до и после лиофилизации препаратов определяли методом агаровых слоев соответственно с индикаторными и контрольными штаммами V. не О1 фаготипов I-VII, а также V. mi, Amn, Pdmn, Cmmmn, E. i. На агаровые слои с контрольными штаммами бактериофаги наносили репликатором.

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе исследования показали, что максимальное количество выживших фаговых частиц наблюдалось при использовании сред высушивания 1, 2, 3 и, в зависимости от фага, находилось в пределах 1,0х107 – 2,8х БОЕ/мл. При лиофилизации со стабилизаторами 4–8 количество жизнеспособных частиц составляло от 1,0х104 до 1,0х107 БОЕ/мл, что в среднем в 20 раз ниже исходных значений. Поскольку низкая концентрация фаговых частиц может привести к изменению спектра литической активности бактериофага, то есть к потере диагностической ценности препарата, среды 4–8 были исключены из дальнейших исследований.

На втором этапе нашей работы была проведена сравнительная оценка эффективности отобранных стабилизаторов в повторных экспериментах. Установлено, что все бактериофаги ТЭПВ, высушенные на средах 1, 2, 3, представляли собой аморфную массу светло-коричневого цвета, полностью растворялись в течение 1-2 минут независимо от защитной среды. Одним из важных показателей сухих препаратов является потеря в массе при высушивании, от которой зависит растворимость и стабильность свойств при хранении. Потеря в массе при высушивании у бактериофагов ТЭПВ-1–7, лиофилизированных со средой 1, составляла в среднем от 1,37 до 2,01 %, со средой 2 – от 1,08 до 1,48 %, со средой 3 – от 5,04 до,49 %. Оптимальные значения показателя потери в массе при высушивании для бактериофагов находятся в пределах 1–3 %. В наших экспериментах такие показатели характерны для образцов бактериофагов ТЭПВ-1–7, высушенных со средами 1 и 2.

Установлено, что при применении трехкомпонентной среды (среда 1) количество жизнеспособных частиц бактериофагов ТЭПВ составило в среднем от 2,9х109 до 4,0х107 БОЕ/ мл, то есть уменьшилось в среднем в 2,1 раза по сравнению с жидкой формой (от,0х109 до 2,0х108 БОЕ/мл). При лиофилизации на двухкомпонентной (среда 2) и однокомпонентной (среда 3) средах количество выживших фаговых частиц находилось в пределах 1,0х109–2,0х10 и 1,4х108–1,0х107 БОЕ/мл соответственно, в среднем отмечалось снижение концентрации фаговых частиц в,2 и 41,3 раза. Полученные данные свидетельствовали о преимуществе защитной среды 1, обеспечивающей лучшую выживаемость бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе лиофилизации (Рис. 1).

Рис. 1 - Изучение выживаемости бактериофагов ТЭПВ-5 (а) и ТЭПВ-6 (б) после лиофилизации со стабилизаторами 1, 2, 3.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение стабильности бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе хранения в условиях, предусмотренных нормативной документацией [4]. Изучение физико-химических (внешний вид, растворимость, рН, потеря в массе при высушивании) и биологических (специфическая активность) свойств лиофилизированных препаратов, хранившихся при температуре (±2) °С, проводили через 1, 2, 3 и 3,5 года, что необходимо для установления их срока годности.

Результаты показали, что наибольшее снижение количества частиц у отдельных бактериофагов ТЭПВ-1–7 происходило в течение первого года. При этом у бактериофагов лиофилизированных со средой 1 количество фаговых частиц снизилось в 3 раза, со средой 2 – в раз, со средой 3 – в 23 раза. В дальнейшем при хранении препаратов снижение концентрации фаговых частиц составило не более 3-5 %. Физико-химические характеристики сухих бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе хранения практически не изменялись.

Анализ полученных данных показал преимущества трехкомпонентной защитной среды (среда 1), которая применялась впоследствии для изготовления 4 экспериментально-производственных серий бактериофагов диагностических холерных ТЭПВ-1–7, лиофилизатов для диагностических целей, представленных на расширенные межлабораторные испытания.

В результате проведенных испытаний установлено, что:

1. Лиофилизаты представляют собой аморфную массу светло-коричневого цвета. После растворения – прозрачная жидкость светло-желтого цвета. Содержимое ампулы полностью растворяется в 1 мл воды очищенной при встряхивании в течение 1 мин, что соответствует предварительно установленному в проекте ТУ пределу растворимости – 2 мин.

2. р препаратов находится в пределах от,8 до 7,0, что соответствует предварительно установленному в проекте ТУ пределу рН от,5 до 7,.

3. Потеря в массе при высушивании находится в пределах 0,7–1,9 %, что соответствует предварительно установленному в проекте ТУ пределу данного показателя – не более 3 %.

4. Специфическая активность, определяемая по количеству фаговых частиц в 1 мл, у лиофилизированных бактериофагов ТЭПВ-1–7 находилась в пределах 9х10– 9х108. Количество фаговых частиц в 1 мл у жидких (коммерческих) препаратов – в пределах 5х107 – 2,8х109.

В процессе лиофилизации, как известно, происходит снижение количества фаговых частиц в 1 мл на 1-2 порядка. В соответствии с ТУ 837-019-01898109-2008 для обеспечения Бактериофаги в медицине и ветеринарии специфической активности жидкие бактериофаги ТЭПВ-1,2,4,5,,7 должны содержать не менее 1х107, а ТЭПВ-3 – не менее 1х10 фаговых частиц в 1 мл. Таким образом, для лиофилизированных препаратов количество фаговых частиц, обеспечивающих специфическую активность бактериофагов ТЭПВ-1,2,4,5,,7 должно составлять не менее 1х10, а ТЭПВ-3 – не менее 1х105.

5. Спектр литической активности лиофилизированных препаратов бактериофагов ТЭПВ-1–7 экспериментально-производственных соответствовал аналогичным показателям коммерческого (жидкого) препарата. Каждый бактериофаг ТЭПВ проявлял литическую активность только в отношении штамма гомологичного фаготипа и не лизировал культуры V.

mi, Amn, Pdmn, Cmmmn и E. Ci.

. На основании данных изучения стабильности лиофилизированных бактериофагов ТЭПВ-1–7 в процессе хранения был установлен срок годности – 3 года (срок наблюдения).

Срок годности жидкого препарата – 2 года.

По результатам испытаний было рекомендовано продолжить изучение стабильности свойств лиофилизированных серий бактериофагов ТЭПВ-1–7 с целью увеличения срока годности до 4 лет, а также направить препарат на государственные испытания для дальнейшего его внедрения в практику здравоохранения.



Pages:     | 1 |   ...   | 3 | 4 || 6 | 7 |
Похожие работы:

«Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Студенческий союз МГУ Биологический факультет ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ XIII МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ СТУДЕНТОВ, АСПИРАНТОВ И МОЛОДЫХ УЧЕНЫХ ЛОМОНОСОВ-2006 12–15 апреля 2006 г. Секция Биология Москва – 2006 УДК 57 Председатель оргкомитета секции Биология Проф. Гостимский С.А. Члены оргкомитета: С.н.с. Ботвинко И.В. Проф. Максимов Г.В. Доц. Медведева М.В. Проф. Соколов Д.Д. Проф. Онищенко Г.Е. С.н.с. Авилова К.В. Ст. преп. Сергеев И.Ю. Доц....»

«В защиту наук и Бюллетень № 8 67 Королва Н.Е. Ботаническую науку – под патронаж РПЦ? (по поводу статьи члена-корреспондента РАН, д.б.н. В.К. Жирова Человек и биологическое разнообразие: православный взгляд на проблему взаимоотношений)119 1. Проблема Проблемы взаимодействия власти и религии, науки и религии, образования и религии требуют современного переосмысления и анализа. Возможен ли синтез научного и религиозного знания, и не вредит ли он науке и научной деятельности, и собственно,...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Чебоксарский филиал учреждения Российской академии наук Главного ботанического сада им. Н.В. Цицина РАН Чувашское отделение Русского ботанического общества РАН Чувашское отделение Териологического общества РАН МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ЭКОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФГБУ Государственный природный заповедник Присурский МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Филиал ГОУ ВПО Российский государственный социальный университет, г. Чебоксары...»

«UNEP/CBD/COP/7/21 Страница 112 Приложение РЕШЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ СЕДЬМЫМ СОВЕЩАНИЕМ КОНФЕРЕНЦИИ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Решение Страница VII/1. Биологическое разнообразие лесов 113 VII/2. Биологическое разнообразие засушливых и субгумидных земель 114 VII/3. Биологическое разнообразие сельского хозяйства 124 VII/4. Биологическое разнообразие внутренних водных экосистем 125 VII/5. Морское и прибрежное биологическое разнообразие 159 VII/6. Процессы проведения оценок 216 VII/7....»

«Министтерство о образован и наук Россий ния ки йской Фед дерации Российск академия наук кая к Не еправител льственны эколог ый гический фонд име В.И. В ф ени Вернадско ого Коми иссия Росссийской Федерации по дел ЮНЕ лам ЕСКО Адми инистрация Тамбо овской облласти Ас ссоциация Объеди я иненный универсиитет имен В.И. Ве ни ернадског го Федералльное гос сударствеенное бю юджетное образоваательное учреж ждение выысшего ппрофессиоональног образо го ования Тамбоввский госсударственный теехническ униве...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/12 РАЗНООБРАЗИИ 15 February 2006 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Куритиба, Бразилия, 20–31 марта 2006 года Пункты 13 и 20 предварительной повестки дня* РЕЗЮМЕ ВТОРОГО ИЗДАНИЯ ГЛОБАЛЬНОЙ ПЕРСПЕКТИВЫ В ОБЛАСТИ БИОРАЗНООБРАЗИЯ Записка Исполнительного секретаря 1. В пункте 8 а) решения VII/30 Конференция Сторон поручила Исполнительному секретарю при содействии со стороны...»

«Материалы международной научно-практической конференции (СтГАУ,21.11.2012-29.01.2013 г.) 75 УДК 619:616.995.1:136.597 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА AEROMONAS Н.Г. КУКЛИНА, И.Г. ГОРШКОВ, Д.А. ВИКТОРОВ, Д.А. ВАСИЛЬЕВ Ключевые слова: Aeromonas, выделение, индикация, питательные среды, микробиология, биотехнология, аэромоноз. Авторами публикации сконструированы две новые питательные среды для выделения и идентификации бактерий рода Aeromonas: жидкая...»

«МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ Московская международная научно-практическая конференция ЭКОЛОГИЯ КРУПНЫХ ГОРОДОВ Проводится в рамках Московского международного конгресса Биотехнология: состояние и перспективы развития 15 - 17 марта 2010 March, 15 - 17 Под патронажем Правительства Москвы Sponsored by Moscow Government The Moscow International Scientific and Practical Conference ECOLOGY OF BIG CITIES Held within the framework of Moscow International Congress Biotechnology: State of the Art and Prospects...»

«Ukraine, Russia, Kazakhstan and Turkmenistan, shows its relationship with the 11-year cycle of solar activity, when it peaks occur during periods of sharp increase or decrease in solar activity near the maximum, and minimum - for periods of low solar activity ( fig.) Among the countries of Eastern and Western Europe is characterized by similar dynamics only for Romania. For other countries the situation is not so clear, it is associated with dominance or high-frequency oscillation periods of...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/COP/8/2 РАЗНООБРАЗИИ 18 April 2005 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Восьмое совещание Бразилия, 20–31марта 2006 года ДОКЛАД О РАБОТЕ ДЕСЯТОГО СОВЕЩАНИЯ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ОРГАНА ПО НАУЧНЫМ, ТЕХНИЧЕСКИМ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ КОНСУЛЬТАЦИЯМ ОГЛАВЛЕНИЕ Страница ПУНКТ 1 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОТКРЫТИЕ СОВЕЩАНИЯ ПУНКТ 2 ПОВЕСТКИ ДНЯ. ОРГАНИЗАЦИОННЫЕ ВОПРОСЫ A. Участники совещания B. Выборы должностных лиц C....»

«Фундаментальная наук а и технологии - перспективные разработки Fundamental science and technology promising developments III Vol. 2 spc Academic CreateSpace 4900 LaCross Road, North Charleston, SC, USA 29406 2014 Материалы III международной научно-практической конференции Фундаментальная наука и технологии перспективные разработки 24-25 апреля 2014 г. North Charleston, USA Том 2 УДК 4+37+51+53+54+55+57+91+61+159.9+316+62+101+330 ББК 72 ISBN: 978-1499363456 В сборнике собраны материалы докладов...»

«УВАЖАЕМЫЕ КОЛЛЕГИ! Министерство здравоохранения Республики Беларусь, учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет, учреждение образования Витебский государственный медицинский университет, ГУО Белорусская медицинская академия последипломного образования, Белорусская общественная организация дерматовенерологов и косметологов приглашают Вас принять участие в работе Республиканской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 100-летию...»

«CBD Distr. GENERAL КОНВЕНЦИЯ О БИОЛОГИЧЕСКОМ UNEP/CBD/WG-ABS/2/2 16 September 2003 РАЗНООБРАЗИИ RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH СПЕЦИАЛЬНАЯ РАБОЧАЯ ГРУППА ОТКРЫТОГО СОСТАВА ПО ДОСТУПУ К ГЕНЕТИЧЕСКИМ РЕСУРСАМ И СОВМЕСТНОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ВЫГОД Второе совещание Монреаль, 1-5 декабря 2003 года Пункты 3, 4, 5, 6 и 7 предварительной повестки дня* ДАЛЬНЕЙШЕЕ ИЗУЧЕНИЕ НЕУРЕГУЛИРОВАННЫХ ВОПРОСОВ, КАСАЮЩИХСЯ ДОСТУПА К ГЕНЕТИЧЕСКИМ РЕСУРСАМ И СОВМЕСТНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЫГОД: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕРМИНОВ, ДРУГИЕ...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН КОМИ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КОМИ ОТДЕЛЕНИЕ РБО МИНИСТЕРСТВО ПРИРОДНЫХ РЕСУРСОВ И ОХРАНЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РЕСПУБЛИКИ КОМИ УПРАВЛЕНИЕ РОСПРИРОДНАДЗОРА ПО РЕСПУБЛИКЕ КОМИ РОССИЙСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Всероссийская конференция БИОРАЗНООБРАЗИЕ ЭКОСИСТЕМ КРАЙНЕГО СЕВЕРА: ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ, МОНИТОРИНГ, ОХРАНА Материалы докладов 3-7 июня 2013 г. Сыктывкар, Республика Коми, Россия Сыктывкар, УДК 574.4:504(470-17+98) (063) ББК...»

«Институт систематики и экологии животных СО РАН Териологическое общество при РАН Новосибирское отделение паразитологического общества при РАН ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ СОВРЕМЕННОЙ ТЕРИОЛОГИИ 18–22 сентября 2012 г., Новосибирск Тезисы докладов Новосибирск 2012 УДК 599 ББК 28.6 А43 Конференция организована при поддержке руководства ИСиЭЖ СО РАН и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 12-04-06078-г) Редакционная коллегия: д.б.н. Ю.Н. Литвинов...»

«Известия Коми научного центра УрО РАН Выпуск 3(15). Сыктывкар, 2013. ХРОНИКА ВСЕРОССИЙСКАЯ НАУЧНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЕ ЭКОСИСТЕМ КРАЙНЕГО СЕВЕРА: ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ, МОНИТОРИНГ, ОХРАНА С 3 по 7 июня 2013 г. в г. Сыктывкар (Республика Коми) состоялась Всероссийская научная конференция Биоразнообразие экосистем Крайнего Севера: инвентаризация, мониторинг, охрана. Инициатор ее проведения – Институт биологии Коми НЦ УрО РАН. Соучредителями выступили Министерство природных ресурсов и охраны...»

«CBD Distr. GENERAL UNEP/CBD/COP/12/10 23 July 2014 RUSSIAN ORIGINAL: ENGLISH КОНФЕРЕНЦИЯ СТОРОН КОНВЕНЦИИ О БИОЛОГИЧЕСКОМ РАЗНООБРАЗИИ Двенадцатое совещание Пхёнчхан, Республика Корея, 6-17 октября 2014 года Пункт 12 предварительной повестки дня* ОБНОВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЕРЕСМОТРА/ОБНОВЛЕНИЯ И ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТРАТЕГИЙ И ПЛАНОВ ДЕЙСТВИЙ ПО СОХРАНЕНИЮ БИОРАЗНООБРАЗИЯ, ВКЛЮЧАЯ НАЦИОНАЛЬНЫЕ ЦЕЛЕВЫЕ ЗАДАЧИ, И ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ПЯТЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ ДОКЛАДОВ Записка Исполнительного секретаря**...»

«Уважаемые коллеги! Миркин Б.М., д.б.н., профессор, Башкирский Оргкомитет планирует опубликовать научные гос. университет материалы конференции к началу ее работы. Приглашаем Вас принять участие в работе П е н ч у ко в В. М., а к а д е м и к РАСХ Н, Для участия в работе конференции Международной научной конференции необходимо до 1 февраля 2010 года Ставропольский гос. аграрный университет Теоретические и прикладные проблемы П е т р о в а Л. Н., а к а д е м и к РА С Х Н, н ап р а в и т ь...»

«В.К. Шитиков, Г.С. Розенберг ОЦЕНКА БИОРАЗНООБРАЗИЯ: ПОПЫТКА ФОРМАЛЬНОГО ОБОБЩЕНИЯ 1. Общий подход к оценке биологического разнообразия 1.1. Развитие концепций и определение основных понятий Понятие биологическое разнообразие за сравнительно короткий отрезок времени получило расширенное многоуровневое толкование. Собственно его биологический смысл раскрывается через представления о внутривидовом, видовом и надвидовом (ценотическом) разнообразии жизни. Однако, в добавление к этому, сначала...»

«НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ СОВЕТ БОТАНИЧЕСКИХ САДОВ И ДЕНДРОПАРКОВ УКРАИНЫ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ЭКОМОНИТОРИНГА И БИОРАЗНООБРАЗИЯ МЕГАПОЛИСА НАЦИОНАЛЬНЫЙ БОТАНИЧЕСКИЙ САД ИМ. Н.Н. ГРИШКА Международная научная конференция РОЛЬ БОТАНИЧЕСКИХ САДОВ И ДЕНДРОПАРКОВ В СОХРАНЕНИИ И ОБОГАЩЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ 28-31 мая 2013 года Первое информационное письмо КИЕВ – 2012 ГЛУБОКОУВАЖАЕМЫЕ КОЛЛЕГИ! Приглашаем вас принять участие в работе Международной научной...»









 
2014 www.konferenciya.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Конференции, лекции»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.